抗黄曲霉毒素单链抗体基因的克隆与表达

为降低黄曲霉毒素抗体制备成本,在已有的能分泌抗黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞系8F6的基础上,成功克隆得到了该单克隆抗体的重链（VH）和轻链可变区（VL）基因片段。通过重叠延伸PCR的方法将轻、重链可变区基因连接,并引入连接肽（Linker）编码序列,构建VH-Linker-VL结构的单链抗体（ScFv）基因,并将该基因克隆到噬菌体表达载体pCANTAB 5E上,使单链抗体以噬菌体展示形式在大肠杆菌TG1中表达。间接竞争ELISA方法检测到该ScFv对黄曲霉毒素B1的抑制率（IC50）值为0.57ng/mL,表明该单链抗体与亲本鼠单抗有相同的抗原结合特异性,且具有很高灵敏度。     

基于ELISA克罗诺杆菌单链抗体制备与鉴定

利用基因工程技术制备克罗诺杆菌特异性单链抗体(sc Fv)。从克罗诺杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,利用RT-PCR反转录合成第一链c DNA后再扩增出抗体的重链可变区(VH)和轻链变区(VL)基因片段,采用重叠延伸PCR的方法,用柔性多肽Linker接头(Gly4Ser)3将VH基因和VL基因拼接成sc Fv基因片段,XhoⅠ﹑Eco RⅠ限制性内切酶双酶切sc Fv后克隆到原核表达载体p ET-26b中构建重组质粒sc Fv-pet-26b,挑取阳性克隆提取重组质粒后转入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,通过His柱进行亲和层析,最后利用ELISA检测单链抗体的活性。成功构建了表达克罗诺杆菌单链抗体的基因工程菌株,通过SDS-PAGE和ELISA试验结果表明,诱导表达的罗诺杆菌单链抗体分子量约为30 k Da,其能与罗诺杆菌特异性结合,可作为免疫检测罗诺杆菌的候选抗体分子。     

基于哺乳动物细胞系的重组乙酰胆碱酯酶表达载体构建研究

：目的 构建具有不同信号肽、载体骨架元件以及乙酰胆碱酯酶编码基因序列的真核表达载体,为基于哺乳动物细胞系表达重组乙酰胆碱酯酶提供前期研究基础。方法 通过NCBI数据库查询苍蝇头部、电鳗鱼发电器官来源的乙酰胆碱酯酶基因序列(mdAChE和eleelAChE),经密码子优化后,选择Humaninsulin、小鼠重链、Human CD33 3种信号肽序列,将其与合成的上述目的基因连接后分别与pCMV3、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.4 3种载体骨架元件进行组合,构建重组乙酰胆碱酯酶的表达载体,随后分别在CHO-S、Expi293F细胞系中进行瞬时转染表达,产物采用镍柱亲和纯化后进行SDS-PAGE与WB分析鉴定。结果 经菌落PCR及DNA测序鉴定,成功构建了4种重组mdAChE酶的表达载体以及3种重组eleelAChE酶的表达载体。SDS-PAGE、western blot的结果表明,基于pcDNA3.1(+)和pcDNA3.4载体骨架元件的重组表达载体可实现重组mdAChE和eleelAChE酶的可溶表达;以pCMV3为载体骨架元件的表达载体,仅在以Human CD33为信号肽时,在CHO-S细胞系中实现重组mdAChE酶的可溶表达,其余情况下均未见有效表达。结论 实现了昆虫、鱼类来源的重组乙酰胆碱酯酶在哺乳动物细胞系的可溶性表达,发现载体骨架元件、信号肽类型对其重组表达具有重要影响,CHO-S以及Expi293F细胞均适合重组乙酰胆碱酯酶的表达,后续还需对影响其酶活、农药敏感性的关键限制性因素开展深入地研究。     

抗克百威单链抗体的可溶性表达载体的构建及鉴定

为构建克百威(carbofuran,CBF)单链抗体(sc Fv)可溶性表达载体,实现其在大肠杆菌中的表达。以p CANTAB5E-sc Fv质粒为模板扩增CBF的重链(VH)及轻链(VL)片段,通过引物设计引入由15个氨基酸组成的连接肽(Gly4Ser)3,经重叠延伸拼接重链及轻链片段,并通过PCR扩增得到sc Fv基因,再与载体p LIP6/GN连接,转化大肠杆菌BL21,阳性克隆质粒经PCR鉴定并测序。重组菌经0.6μmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)及低温诱导表达重组单链抗体,并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用ELISA法检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒p LIP6/GN-sc Fv含有插入片段,sc Fv与碱性磷酸酶(AP)相连得到重组蛋白的分子量接近78 ku,可被游离的CBF竞争性抑制,IC50值为26.80 ng/m L。这说明成功构建了重组质粒p LIP6/GN-sc Fv并实现了其在大肠杆菌中的可溶性表达,为研究其在免疫分析方法中的应用奠定了基础。     

GII.3型诺如病毒重组衣壳蛋白的表达和纯化鉴定

目的通过杆状病毒表达系统,获取高纯度GⅡ.3型诺如病毒重组衣壳蛋白,为制备抗GⅡ.3型诺如病毒单克隆和多克隆抗体提供免疫原。方法将GⅡ.3型诺如病毒衣壳蛋白基因片段修饰后插入p HTA表达载体中,经测序鉴定,将鉴定正确的重组质粒转化到MAX Efficiency~DH10Bac~(TM)感受态细胞中,获取表达杆粒并转染SF9细胞,表达GⅡ.3型诺如病毒重组衣壳蛋白。重组蛋白用Ni-NTA His蛋白亲和柱纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blot)方法鉴定。结果 SDS-PAGE和Western blot结果表达了分子量约为60 k Da的重组蛋白,动物试验表明重组蛋白具有较好的免疫原性,为制备抗GⅡ.3型诺如病毒单克隆抗体和多克隆抗体、建立相应的免疫学检测方法奠定了基础。结论构建了GⅡ.3型诺如病毒衣壳蛋白表达载体,并获得GⅡ.3型诺如病毒重组衣壳蛋白。     

重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的高效表达

目的研究重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的表达。方法用RT-PCR法从人胎肝中克隆出人蛋白C轻重链基因,用PCR突变法获得人活性蛋白C的全基因,将所得全基因连接入哺乳动物细胞表达载体,并转染293细胞研究其表达和活性。结果成功得到重组人活性蛋白C基因,并成功构建哺乳动物细胞表达载体和转染293细胞获高效表达以及相关活性数据。结论通过以上方法可以获得重组人活性蛋白C基因,并实现了在哺乳动物细胞中的高效表达。     

抗呋喃它酮代谢物噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建抗呋喃它酮代谢物(AMOZ)的衍生物噬菌体单链抗体库。方法：从分泌抗AMOZ 的单克隆抗体的杂交瘤细胞系(BC3-E8)中提取总RNA,经RT-PCR 反转录成cDNA,设计通用简并引物,PCR 扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)。经重叠延伸PCR (SOE-PCR),将VH 和VL 基因用编码(G1y4Ser)3 的linker随机拼接成单链抗体(scFv)基因,然后将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E 中,转化大肠杆菌(Escherichia coli) TG1 感受态细胞,经辅助噬菌体M13K07 超感染,建立噬菌体单链抗体库。随机挑取10 个阳性克隆,经PCR 和双酶切鉴定,并测序。登陆DNAMAN 软件对序列进行分析、比对。结果：成功扩增VH、VL 及scFv 基因,并得到库容为1.2 × 106 的噬菌体抗体库,噬菌体的滴度为2.0 × 1010PFU,PCR 鉴定及双酶切鉴定文库重组率较高,软件对序列比对结果显示,scFv 基因全长序列之间差异为8.38%,VH 序列差异为3.68%,VL 序列差异为14.34%,且序列差异多集中在CDR 抗原结合区域对应的核酸序列上。结论：已构建抗呋喃它酮代谢物的衍生物噬菌体单链抗体库,为进一步富集筛选并表达抗AMOZ 的衍生物的单链抗体提供参考。     

单增李斯特菌胶体金免疫层析试纸条的研制

以单增李斯特菌(LM)内化素A蛋白(InlA)单克隆抗体为基础,研制其胶体金免疫层析检测试纸条。方法 采用DNAStar软件对LM inlA全长基因编码蛋白进行抗原表位分析,截取部分inlA基因片段构建原核表达质粒,诱导表达和纯化获得重组蛋白。以该蛋白免疫BALB/c小鼠,筛选高效分泌抗InlA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体;以双抗体夹心的原理研制胶体金免疫层析检测试纸条,并对其特异性、敏感性、稳定性进行评价。结果 筛选到2株高效分泌抗InlA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体属于IgG1亚类,小鼠腹水抗体效价为1∶64000;研制的试纸条可与LM发生阳性反应,而与非LM李斯特菌、链球菌、鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌O157∶H7等食源性致病菌均不发生阳性反应;LM纯培养物敏感性为2.4×10^5cfu/ml,模拟猪肉样品敏感性为4.0×10⁶ cfu/ml;4℃保存期可达16周以上。结论 研制的胶体金免疫层析试纸条具有快速、特异、敏感等优点,可以用于样品中LM的快速检测。     

抗β-葡萄糖苷酸酶(β-GUS)兔单克隆抗体的制备和鉴定

通过免疫兔子、细胞融合、筛选杂交瘤细胞、构建重组载体、抗体纯化等步骤,成功制备出抗β-葡萄糖苷酸酶(β-GUS)兔单克隆抗体。运用间接ELISA法测定该兔单克隆抗体的相关特性,结果表明该兔单克隆抗体的效价为64000左右,亲和常数为2.13×109L/mol。间接ELISA检测β-GUS蛋白时,其最低检测限为50ng/mL。本次试验为研制定性或定量检测β-GUS蛋白的ELISA试剂盒奠定了基础。     

新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原的重组表达及其单克隆抗体的制备

目的 制备新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白重组抗原及其单克隆抗体。方法 根据公布的新冠病毒全基因组序列,构建其核衣壳蛋白的表达载体pET-28a-N, 并转化至E. coil BL21(DE3)进行原核表达, ELISA及Western blot鉴定纯化后的核衣壳蛋白重组抗原的特异性并免疫Balb/c系小鼠, 基于杂交瘤融合技术筛选获得可持续分泌新冠病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的细胞株, 并基于ELISA及生物膜层干涉技术鉴定单克隆抗体的特异性和亲和力。结果 基于大肠杆菌原核表达获得新冠病毒核衣壳蛋白的重组抗原, 其纯度大于90%, 筛选获得7株可分泌特异性结合新冠病毒核衣壳蛋白的杂交瘤细胞株, 经Western blot、ELISA及分子相互作用分析等方法证实所获得的单克隆抗体与核衣壳蛋白具有优良的结合特异性和结合活性, 其中的7E11、7E8单克隆抗体与核衣壳蛋白抗原的亲和力常数分别为1.69×10-9、2.031×10-9M, 可作为抗体元件应用于新冠病毒的快速免疫分析领域。结论 获得高特异性的新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白重组抗原及其单克隆抗体。     

地西泮单克隆抗体的制备及其酶联 免疫吸附检测方法的建立

目的 制备地西泮(Diazepam DZP)单克隆抗体,并且对制备的抗体进行一系列性质鉴定。方法 利用EDC法合成免疫原和包被原,用免疫原免疫Balb/C小鼠,当效价到1:16000以后取小鼠脾脏与SP2/0进行细胞融合。然后采用竞争结合双阳性两步筛选法,筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,并且利用有限稀释亚克隆方法得到单株细胞,采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。接着利用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水型抗体进行纯化,利用酶联免疫吸附,SPR等方法对纯化后的抗体进行性质鉴定。结果 成功合成了地西泮免疫原和包被原,免疫Balb/C小鼠7次后效价达到1:16000,最终制备出单克隆抗体,抗体解离常数(KDs)为4.0985×10_-7M,且与大部分结构类似物没有明显的交叉反应。应用此抗体建立间接竞争ELISA法,抗体的IC₅₀=10.8ng/mL,检测范围为0.45ng/mL-862ng/mL。结论 制备出了地西泮单克隆抗体,为地西泮的免疫学检测提供了有力的支持。     

高有机溶剂耐受性的苯并(a)芘单克隆抗体制备及其免疫反应特性研究

目的 制备适应油脂样品中苯并(a)芘[Benzo(a)pyrene,BaP]检测需求的抗BaP单克隆抗体。方法 利用杂交瘤单克隆抗体技术制备抗BaP的抗体,在抗体筛选过程中使用高浓度的有机溶剂(50%甲醇)来选择具有较高有机溶剂耐受能力的抗体,并利用间接竞争酶联免疫吸附法考察了抗体的免疫反应特性。结果 筛选获得一株对有机溶剂有较高耐受能力的、稳定分泌BaP单克隆抗体的细胞株2H10,该抗体为IgG1亚型,可耐受高浓度的甲醇、丙酮、二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和二甲基甲酰胺(Dimethylformamide,DMF)。60%甲醇和60% DMSO作为样品稀释液时,抗体对BaP的IC₅₀分别为81.4和24.5 ng/mL,以60% DMSO作为样品稀释液,可以显著降低BaP抗体对其它多环芳烃化合物的交叉反应率。结论 本研究获得高特异性的BaP人工抗原及高有机溶剂耐受性的抗BaP单克隆抗体。     

小麦球蛋白单克隆和多克隆抗体制备及建立酶联免疫吸附法快速检测技术

目的建立小麦球蛋白的ELISA检测技术,用于蛋白质掺假以及过敏原成分的快速检测。方法从麦胚粉中提取球蛋白,抗原免疫Balb/c小鼠进行4次免疫后,通过脾脏细胞杂交瘤技术及间接ELISA筛选制备单克隆抗体,同时制备兔抗小麦球蛋白的多克隆抗体。通过棋盘滴定法,初步确定单克隆抗体和多克隆抗体的最佳工作浓度,建立双抗夹心ELISA。结果通过免疫和杂交瘤技术获得了抗小麦球蛋白的单克隆抗体,纯化后抗体的效价均达到1:107,通过免疫兔制备的多克隆抗体经纯化后效价在1:2.4×105左右,所建立的双抗体夹心ELISA方法最低检测限为10 ng/m L,与其他物种的蛋白不发生交叉反应。结论本文建立的双抗体夹心ELISA方法具有良好的特异性和灵敏度,为建立乳品中小麦成分掺假及过敏原成分快速检测提供理论依据。     

毒死蜱单克隆抗体制备及icELISA检测方法优化

目的制备毒死蜱单克隆抗体,建立icELISA(间接竞争酶联免疫吸附方法)检测方法并对其进行优化。方法以毒死蜱为基础物质,制备半抗原CPF-H1和CPF-H2,偶联蛋白制备人工抗原,进而通过免疫、细胞融合、筛选得到特异性的单克隆抗体,建立毒死蜱的icELISA检测方法,并对其分析条件进行优化。结果质谱鉴定结果表明毒死蜱半抗原制备成功;半抗原偶联蛋白,紫外全波长扫描鉴定人工抗原制备成功;免疫动物、细胞融合并制备单克隆抗体;建立了icELISA检测方法,优化得到最佳反应条件:PBST为标准品稀释液,包被抗原最佳稀释倍数为1:1000,抗体最佳稀释倍数为1:1000,一抗反应最佳时间为40 min,二抗反应最佳时间为30 min,制得毒死蜱标准曲线,毒死蜱对抗体的IC_(50)为73-25 ng/mL,线性范围IC_(20)~IC_(80)为32.52~260ng/mL,LOD为19.34 ng/mL。结论本研究为毒死蜱快速检测技术奠定了理论基础,对保障人们的身体健康具有重要的意义。     

双酚A单克隆抗体的制备及酶联免疫分析方法的建立

采用活泼酯法将双酚A的结构类似物双酚酸与载体蛋白偶联制备人工抗原,用制备的人工抗原免疫BALB/c小鼠,采用聚乙二醇法进行细胞融合制备双酚A单克隆抗体,成功获得一株分泌抗双酚A单克隆抗体的细胞株3H1,经鉴定抗体属于IgG1亚型,轻链为κ,并建立了间接竞争酶联免疫分析法。线性范围为1～50 ng/mL,最低检测限为0.43 ng/mL,半数抑制浓度为6.56 ng/mL。回收率为82.83%～101.94%,变异系数为2.94%～12.95%。该方法具有较高的灵敏度和特异性,具有良好的应用前景。     

基于HTS-ELISA的单克隆抗体分泌 杂交瘤细胞筛选技术进展

基于单克隆抗体的各类免疫分析技术是现代食品安全快速检测技术发展的主要方向之一,因此,高活性单克隆抗体的制备方法自然为众多研究者所关注。通常单克隆抗体的制备过程涉及到很多技术环节,包括抗原制备、免疫剂量设计、细胞融合、活性杂交瘤细胞筛选以及抗体纯化等,其中分泌单克隆抗体杂交瘤细胞的筛选环节是单克隆抗体制备的关键一环。 为此,本文主要介绍了一种基于HTS-ELISA的高活性单克隆抗体分泌杂交瘤细胞的筛选技术,重点是对融合细胞的低密度培养、特殊仪器设备和在筛选过程中如何依据拖孔数(Trailing)来判断杂交瘤细胞的活性等相关的原理和技术进行了介绍,旨在为我国高活性单克隆抗体制备技术的发展及加快食品安全快速检测技术的发展提供一个参考方法。     

异丙威单克隆抗体的制备及鉴定

异丙威是我国农业生产中常见的杀虫剂,在果蔬、粮食和烟草等中都有广泛应用,然而这类农药也具有较强生物毒性。为了制备异丙威单克隆抗体,以实现对农药异丙威药物的快速检测。本文以2-异丙基苯酚等为原料,合成异丙威半抗原及人工抗原,并通过免疫小鼠、细胞融合、克隆、筛选获得单克隆抗体细胞株,经腹水诱导法及辛酸-硫酸铵沉淀法制得异丙威单克隆抗体,通过间接竞争ELISA法对抗体的特异性进行鉴定。结果表明,制备的异丙威单克隆抗体检测范围为1.88~82.80 ng/m L,抗体的IC50为11.70ng/m L,最低检测限为0.54 ng/m L,抗体与克百威、西维因、涕灭威、灭多威、2-异丙基苯酚5种异丙威结构类似物均无明显交叉反应,具有高特异性,能够满足农产品中异丙威残留检测的要求。异丙威单克隆抗体的制备为异丙威快速检测产品的开发奠定了基础。     

酚酞单克隆抗体的制备

目的 建立免疫学快速检测减肥类保健食品中非法添加的酚酞, 制备酚酞单克隆抗体并进行评价。方法 利用碳二亚胺(carbodiimide, EDC)法合成免疫原和包被原, 用免疫原免疫Balb/C小鼠, 取小鼠脾脏与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合。采用竞争结合双阳性两步筛选法, 筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞, 利用有限稀释亚克隆方法得到单株细胞; 采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。利用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水型抗体进行纯化, 利用酶联免疫吸附法鉴定纯化后的抗体。结果 成功合成了酚酞-BSA免疫原和酚酞-OVA包被原, 筛选获得酚酞杂交瘤细胞株FT/BSA/2019, 单克隆抗体的效价1×105。结论 本研究初步建立了特异性高的酚酞单克隆抗体的制备方法。     

Development of a Bispecific Monoclonal Antibody to Pesticide Carbofuran and Triazophos Using Hybrid Hybridomas

ABSTRACT:  A mouse hybrid hybridoma (tetradoma) was derived from fusing hybridomas producing monoclonal antibody to N-methylcarbamate pesticide carbofuran with hybridomas producing monoclonal antibody to organophosphorus pesticide Triazophos. The prepared tetradoma line (12C1 to 2H12) secreted hybrid immunoglobulin exhibiting parental and bispecific binding characteristics. The effect of relevant physicochemical factors on the immunoassay based on the 12C1 to 2H12 bispecific monoclonal antibody had been studied to optimize the ELISA performance. The developed immunoassay showed that the detection limit (I₂₀) were 0.36 and 1.89 ng/mL for triazophos and carbofuran, respectively, without obvious cross-reactivity to other related compounds. Water samples spiked with triazophos at 0.5, 1, and 5 ng/mL or carbofuran at 5, 10, and 20 ng/mL were directly analyzed by the developed ELISA format. The mean recovery of triazophos and carbofuran were 108.1% and 107.5%, with variation coefficient of 15.9% and 17.7%, respectively.