反硝化产碱菌Alcaligenes sp.TB氧化亚氮还原酶基因的克隆表达及酶学性质研究

氧化亚氮(N2O)是一种重要的温室气体,对全球温室效应的贡献非常显著,反硝化细菌中存在氧化亚氮还原酶(nitrous oxide reductase,Nos)能将其最终还原成氮气。将生物转鼓反应器中筛选得到的一株高效反硝化产碱菌Alcaligenes denitrificans TB作为供试菌株,构建含有nosZ基因序列的原核重组表达菌株,经IPTG诱导完成在大肠杆菌中的表达,其最佳诱导条件为:诱导剂IPTG终浓度为0. 5 mmol·L-1,诱导温度为28℃,诱导时间为6 h,菌体初始浓度(OD600)为0. 67。再利用亲和层析分离纯化得到重组蛋白,通过检测显示重组菌E. coli BL21(DE3)-pET28b-nosZ酶活力是出发菌株Alcaligenes sp. TB的2. 09倍,蛋白相对含量是其10. 58倍。进而考察了反应体系pH和反应温度对酶催化反应的影响,结果显示,当pH为7. 0,温度为40℃时得到最佳酶活。     

康氏木霉发酵液提取木聚糖酶的酶学性质研究

对康氏木霉（Trichoderma Koningii）发酵产木聚糖酶的酶学性质进行了研究。结果表明；该木聚糖酶的最适反应温度为65℃，酶反应最适pH为6．0；该酶在20～60℃范围内能保持87％以上的酶活，在pH3．0-9．0范围内能保持85％以上的酶活；金属离子K^＋、Ba^2＋、Pb^2＋、Fe^2＋、Fe^3＋、Al^3＋和12mmol／L的Cu^2＋对木聚糖酶的活性有抑制作用，而Ca^2＋，Zn^2＋和4mmol／L Cu^2＋等金属离子对该酶有激活作用。     

黑曲霉产木聚糖酶的特性

研究了木聚糖酶产生菌黑曲霉(A．niger)238的产酶特性和麸曲的浸提条件。并对其浸提酶液进行浓缩．结果表明，菌株黑曲霉(A．niger)238产木聚糖酶受诱导物的影响，发酵时间在68～72h期间达到产酶高峰，酶活力为286U／mL．最佳氮源为(NH4)2SO4，装料量为每瓶10g，接种量为每瓶0．3mL．其发酵麸曲用固液比为1：5的2g／dL CaCl2溶液，30℃浸提1．5h；浸提液采用25℃，40kPa，冷却水温度18℃条件超滤浓缩可获得90％以上回收率．     

L-天冬氨酸α-脱羧酶异源表达和转化条件的优化

为提高L-天冬氨酸α-脱羧酶粗酶液催化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸的效率,研究了诱导剂添加时间、诱导剂浓度、诱导温度和培养时间对重组菌株产酶的影响,并优化了粗酶液的反应温度、pH和底物浓度等转化条件.得到最优诱导条件:在OD600达到0.6左右时加入诱导剂IPTG 0.5 mmol/L、25℃下诱导表达18h时,酶活力达...     

重组大肠杆菌生产人血管抑素的发酵条件

对重组人血管抑素表达菌株pQE32-AGN的生长及产物表达规律进行了探索，确定了最佳发酵条件．培养温度为37℃，初始pH7．0，OD600为0．8～1．0时开始诱导，诱导持续时间为6h，诱导剂浓度为0．1mmol／L，最终目的产物达到菌体总蛋白的35％，rhAGN的表达量达到560mg／L．     

血红密孔菌漆酶催化肾上腺素氧化的研究

漆酶的催化活性和稳定性是基于漆酶催化的生物传感器的核心。用循环伏安谱和分光光度法为手段研究了血红密孔菌漆酶催化肾上腺素氧化的反应机理和最适反应条件。在磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液中，漆酶催化肾上腺素氧化的最适pH值是5．0，最适反应温度是50℃，最适缓冲液浓度为0．1mol／L，K。值为37，5μmol／L。漆酶在55℃保温150min后保持原来活性的50％；在4℃下保存1周后，酶保持原来活性的85％。结果表明，血红密孔菌漆酶有较好的活性和稳定性。     

木薯醇腈酶部分酶学性质研究

对利用基因重组技术获得的木薯醇腈酶（HNL）的酶学特异性进行研究，确定了其部分酶学性质。重组木薯HNL的最适温度为50℃，最适pH值为5．5。重组木薯HNL在60℃条件下，保温30min后仍具有90％的酶活力，说明温度稳定性较好；在pH4．0～6．0的条件下，获得的相对酶活仍大于80％。     

吸附交联法和包埋法固定化混合酶研究

对从自然界分离得到的Microbacterium sp．OU01进行发酵,制得粗酶液（壳聚糖酶和伊肛氨基葡萄糖苷酶混合液）,采用吸附交联法及包埋法对其进行固定,研究其固定化的最优条件和固定化酶的酶学性质。结果表明,游离混合酶液的最佳PH为5．6,最适反应温度为50℃。吸附交联法固定化酶的最佳条件为：戊二醛体积分数5．0％,加酶量15mL（49．51U／mL）,固定化时间6h。该条件下制得的固定化酶的最适pH为4．5,最适反应温度为60℃。包埋法固定化酶的最佳条件为：海藻酸钠质量浓度10g／L,CaCl。质量浓度15g／L,加酶量为1mL（50．35U／mL）／5mL质量浓度10g／L海藻酸钠,固定化时间20min。该条件下制得的固定化酶的最适PH为5．0,最适反应温度为50℃。固定化酶酶解壳聚糖所得产物中含D-氨基葡萄糖,说明粗酶液中的壳聚糖酶和外切-β-D-氨基葡萄糖苷酶被同时固定。通过对游离酶和固定化酶稳定性的研究,表明吸附交联固定化酶更适于工业化应用生产D-氨基葡萄糖。     

草菇半纤维素酶系统的诱导、分布及初步定性

以蔗糖、果胶、羧甲基纤维素或木聚糖为碳源培养草菇（Volvariella volvacea)，对所产生的半纤维素酶进行初步研究发现，半纤维素酶系主要是由木聚糖诱导，半纤维素酶中的木聚糖酶分布在胞外，木糖糖苷酶分布在胞内，阿拉伯糖苷酶胞内胞外都有分布，木聚糖酶的最适反应温度为60℃，最适反应Ph为5.8，在PH5.4-7.0时比较稳定，保温1h酶活的半衰温度是55℃，木糖糖苷酶的最适反应温度为55℃，最适反应PH为6.6，在PH6.6-7.4时比较稳定，保温1h酶活的半衰温度是52℃，阿拉伯糖苷酶的最适反应温度为60℃，最适反应PH为5.0，在PH4.6-6.2时比较稳定，保温1h酶活的半衰温度为60℃。     

影响kluyveromyces fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的因素

研究了酶反应的温度、pH值、底物浓度和反应时间等对kluyveromyces fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的影响．结果显示，以乳糖为底物．kluyveromyces fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最适温度为60℃，最适pH值为6．0，酶法合成低聚半乳糖的产率随着底物浓度增加而增加．kluyveromyces fragilis β-D-半乳糖苷酶催化低聚半乳糖合成的初速度较快．随着反应时间延长．反应速率降低，反应20h酶反应达到平衡．以660mg/mL乳糖为底物．在最适酪反应条件下，酪法合成低聚半乳糖的产率为207．12mg／mL。     

草菇纤维素酶系统的诱导、分布及初步定性

以蔗糖、果胶、羧甲基纤维素、木聚糖或稻草为碳源培养草菇（Volvariella volvacea），并对它所产生的纤维素酶进行初步研究，发现纤维素酶系主要是由纤维素诱导产生，纤维素酶中的β－葡萄糖苷酶和纤维二糖酶分布在胞内，内切葡聚糖酶分布在胞外。β－葡萄糖苷酶的最适反应温度为60℃,最适pH为6.6，在pH6.6-7.8时比较稳定，保温1h酶活的半衰温度是45℃，纤维二糖酶的最适反应温度为50℃、最适pH为5.8，在pH6.2最稳定，保温1h酶活的半衰温度是44℃，内切葡聚糖酶的最适反应温度为60℃，最适pH为5.4，在pH6.6-7.0时比较稳定，保温1h酶活的半衰温度是58℃。     

中温α-淀粉酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的高效表达

利用高效表达载体pWB980,实现了Bacillus subtilis BF7658中温α-淀粉酶基因amy在B．subtilis DB403中的高效表达,活力达到770U／mL．经多步纯化,重组酶AMY的比活达到35．8U／mg,纯化倍数为1．7,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS—PAGE检测,重组酶AMY相对分子质量为4．8×10^4．对酶学性质进行分析,重组酶AMY的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6．0．     

固态发酵产木聚糖酶条件优化及其酶学性质初步研究

以树干毕赤酵母作为发酵菌株对其固态发酵产木聚糖酶的条件进行优化,并对木聚糖酶的性质进行初步研究.由试验结果可知,最优培养条件为玉米芯与小麦麸皮质量比为1∶1,初始水分含量为80%,培养基的基质密度为0.7～0.9 g/mL.28℃下培养9 d,木聚糖酶活力最高达到5 536 U/g.该酶的最适反应pH为6,在pH 6~8时酶活稳定性较好,保温1 h后仍可保留90%以上的酶活;最适温度为60℃,在50~60℃时热稳定性较好;Zn2+、Ca2+和Cu2+对木聚糖酶的活力具有微弱促进作用,Fe2+、Fe3+和Mn2+对木聚糖酶的抑制作用比较明显.     

C-端设计定点突变提高Streptomyces Avermitilis壳聚糖酶稳定性及催化活性

为提高阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis) SaCsn46A壳聚糖酶的温度稳定性,利用SWISS-MODEL在线服务器,以链霉菌SirexAA-E壳聚糖酶(PDB登录号：4ily.1A)为模板对SaCsn46A的蛋白结构进行同源模拟,将预测获得的SaCsn46A蛋白结构提交至在线预测软件PoPMuSiC-2.1,寻找对SaCsn46A稳定性有显著影响的氨基酸残基,通过定点突变构建突变体,在大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta中异源表达野生型壳聚糖酶及突变体。经Ni-NTA亲和层析获得电泳纯重组酶蛋白,测定野生型壳聚糖酶及突变体G237A的酶学性质,发现突变体最适温度提高5℃,并且温度稳定性及pH稳定性显著提升。为进一步提高突变体的表达效率,对突变体表达菌株进行诱导条件优化,确定最优条件为IPTG浓度0.7 mmol/L,诱导温度20℃,诱导时间8 h。     

草菇木聚糖酶的纯化提取和酶学性质

草菇产胞外木聚糖酶通过各级浓缩和纯化，获得接近电泳纯蛋白．通过SDS—PAGE测得相对分子质量为24500．木聚糖酶为糖基化修饰的蛋白，含有质量分数20．24％的糖．O-糖基化能增加木聚糖酶的活性，O-和N-糖基化都能提高木聚糖酶的稳定性．5min反应，草菇木聚糖酶在60℃和pH值5.65时活性最高．在此条件下，该酶的Km值为3．87mg／mL，Vmax为1250IU／mg．纯酶的稳定pH值为6．54，57℃时半衰期为1h。     

微生物发酵法产环氧化物水解酶的研究

从土壤中筛选出一株能将模型底物缩水甘油苯基醚水解为3-苯氧基-1，2-一丙二醇的环氧化物水解酶的芽孢杆菌H-14-1．此茵培养的最佳碳源为1％的葡萄糖，最佳的氮源为1％的NH4Cl和1％牛肉膏，培养基的初始pH为6．5，培养的最佳温度和时问是30℃下培养36h，低浓度底物缩水甘油苯基醚对该酶具有诱导作用，同时培养基中金属Cu外离子对产酶有促进作用．酶学性质的试验表明，该酶的最适反应温度为35℃，最适pH为7．5，40℃以下酶具有较好的热稳定性，pH6．5～8．0范围内酶的稳定性较佳，Mg^2＋和Ca^2＋离子对酶的活性有促进作用．     

固定化胰蛋白酶及其用于制备酪蛋白磷酸肽(CPPs)的实验研究

以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂进行胰蛋白酶的固定化实验。实验条件：壳聚糖0．2g，交联剂浓度9％，交联温度30℃，交联时间2h，加酶量0．8mg，pH值8．0，固定化时间1h，固定化温度4℃。实验结果表明：固定化胰蛋白酶的最适温度为55℃，比溶液酶提高了15℃，活力回收率为50．8％。此外进行了利用固定化胰蛋白酶制备酪蛋白磷酸肽(CPPs)的实验，测定了其持钙能力，发现CPPs浓度为0．5g／L和0．2g／L时能完全阻止磷酸钙沉淀生成，浓度为0．1g／L时能使磷酸钙沉淀生成推迟20min，浓度为0．06g／L和0．04g／L时能使磷酸钙沉淀生成推迟10min。     

玉米麸皮中阿魏酰低聚糖的制备

以玉米麸皮为原料,利用纤维素酶辅助木聚糖酶制备阿魏酰低聚糖,通过正交试验对制备条件进行了优化,得到最佳制备条件：反应温度60℃,pH值5．0,反应时间36h,纤维素酶质量浓度8g／L,木聚糖酶质量浓度6g／L,底物质量浓度165g／L,在此条件下,产物中阿魏酰低聚糖的浓度达到2．127mmol／L．     

半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件

从嗜热脂肪芽孢杆菌(IAM11001)中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB,构建具T7强启动子的PET-20-(b)-BgaB质粒，并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，经IPTG诱导的后，重组菌周质中乳糖酶酶活达到0.12U/mL，胞内酶活为1.35U/mL，比酶活为6.66U/mg蛋白，比酶源菌产生的酶活提高5倍，通过对IPTG诱导时机，诱导浓度和诱导时间的优化研究，重组细菌产生的比酶活进一步提高至酶源菌的90倍。     

色氨酸酶在大肠杆菌周质中的分泌融合表达

按照大肠杆菌偏爱密码子合成编码“BspTI位点一连接肽（Gly—Ser—Gly—Ser—Gly一6His—Tag—Ek—site（Asp—Asp—Asp-Asp—Lys）”序列的DNA序列,利用重叠延伸拼接技术,将其与色氨酸酶基因TnaA拼接,利用BspTI和HindⅢ重组至pET-39二硫键形成蛋白DsbA基因的下游,转化表达宿主EscherichiacoliBL21（DE3）,成功构建分泌融合表达型色氨酸酶基因工程菌．通过摇瓶培养实验研究了诱导剂浓度、诱导温度及诱导时间对色氨酸酶活性的影响．工程菌以舍2％甘油的LB为培养基,A600=0．5时,加入终浓度为0．05mmol／L的Isopropyl伊D-1-thiogalactopyranoside（IPTG）,30℃诱导培养8h,可在周质空间中表达高活性的色氨酸酶融合蛋白．在培养基中添加0．5％的甘氨酸,酶活可提高6．3倍．本实验首次实现了色氨酸酶基因的周质分泌融合表达．