胰蛋白酶水解对乳蛋白抗原性影响的研究

以胰蛋白酶为水解用酶,利用小鼠动物模型从体外和体内两个方面研究了水解作用对牛乳蛋白抗原性的影响。结果表明,胰蛋白酶水解的最适条件为50℃,E/S为0.6%下水解1.5 h。此水解条件下乳蛋白的总致敏性降低最多,分别为α-乳白蛋白(α-LA)抗原性降低率为80.16%,β-乳球蛋白(β-LG)抗原性降低率为51.94%,酪蛋白(CN)抗原性降低率为73.26%。动物实验表明:酶解组小鼠过敏症状较未水解的牛乳蛋白组相比明显减轻。与乳蛋白相比,酶解物显著抑制特异性IgE的产生,IgE质量浓度下降了42.36%。血浆组胺实验表明,酶解物降低血浆中组胺的释放,组胺质量浓度比乳蛋白组下降了32.77%。     

酶解作用对牛乳β-lg抗原性影响的研究

牛乳β-乳球蛋白(β-lg)是胎儿出生后遇到的第一个外来过敏原,并且它是导致牛乳蛋白过敏的主要过敏原。胰蛋白酶对β-lg的水解作用可以导致其空间三维结构的变化,但是该酶诱导β-lg蛋白结构变化对其致敏性影响的意义还不清楚。为了探明水解作用对β-lg致敏性或者抗原性的影响,利用小鼠动物模型从体外(脾淋巴细胞增殖)和体内(IgE水平和组胺水平)两个方面研究了水解作用对β-lg致敏性的影响。体外细胞增殖实验结果表明,和β-lg水解物相比,β-lg能够显著刺激脾淋巴细胞增殖(P=0.01);ELISA方法检测小鼠血清和小肠液IgE(免疫球蛋白E)抗体水平结果表明β-lg组小鼠血清IgE水平要高于β-lg水解物刺激组小鼠(P=0.03),而小肠液中IgE水平和血清IgE水平变化趋势一致,但是整体水平要显著高于血清(P=0.002)。血浆组胺实验表明β-lg免疫组小鼠血浆中组胺水平明显高于β-lg水解物免疫组(P=0.001)。     

适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉的致敏性评价

牛奶是婴儿饮食中最早引入的食物之一,也是引起食物过敏最常见的原因之一。因此,低致敏奶粉的研制具有重要意义。该文采用4周龄雌性BALB/c小鼠,以灌胃方式致敏。将乳清蛋白浓缩物作为阳性对照,通过观察过敏症状,计算脾脏系数,测定血清中总免疫球蛋白E(IgE)和组胺含量,对适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉进行致敏性评价。结果表明:乳清蛋白浓缩物组出现了明显过敏症状,血清中总免疫球蛋白E(IgE)、组胺含量以及脾脏系数显著高于空白及佐剂对照组,说明乳蛋白致敏模型成功建立;适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉组无过敏症状,与空白组及致敏佐剂组相比,血清中总免疫球蛋白E(IgE)、组胺含量以及脾脏系数均无显著差异,说明适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉未引起小鼠过敏;同样,由于深度水解破坏了乳清蛋白抗原表位,深度水解乳清蛋白粉也未引起小鼠致敏;而普通脱脂奶粉致敏小鼠血清中总免疫球蛋白E(IgE)、组胺含量以及脾脏系数均显著高于空白组及致敏佐剂组,说明普通脱脂奶粉导致小鼠致敏。因此,适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉可有效降低或缓解牛奶过敏症状,但仍有待于更多临床试验的验证。     

乳清蛋白-低聚异麦芽糖模拟胃液消化过程中抗原性的变化

目的 研究乳清蛋白-低聚异麦芽糖和乳清蛋白在模拟胃液消化过程中抗原性及游离氨基酸的变化。方法 乳清蛋白(WPI)-低聚异麦芽糖制备后, 对WPI-低聚异麦芽糖及WPI模拟胃液消化过程中的抗原性变化和游离氨基酸含量进行分析。结果 糖基化后乳清蛋白中精氨酸、酪氨酸、胱氨酸和赖氨酸的含量显著降低。经过模拟胃液消化, 乳清蛋白和乳清蛋白-低聚异麦芽糖中α-乳白蛋白的抗原性降低到1 μg/mL以下, 乳清蛋白中β-乳球蛋白抗原性降低到42.83 μg/mL, 乳清蛋白-低聚异麦芽糖中β-乳球蛋白抗原性降低到15.66 μg/mL。结论 经过模拟胃消化, 乳清蛋白-低聚异麦芽糖中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性比乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性低; 在模拟胃液消化过程中, 乳清蛋白-低聚异麦芽糖比乳清蛋白更容易受到胃蛋白酶酶解。     

羊乳清蛋白部分和深度水解工艺、水解物致敏性及肽谱分析

利用羊乳清蛋白制备低致敏性配料是目前乳品工业的研究热点。乳清蛋白是乳中主要的蛋白质之一,也是引起婴幼儿过敏反应的主要成分,将蛋白质水解为小分子肽是降低其致敏性的有效方法。以山羊乳清蛋白为原料,研究了部分水解乳清蛋白和深度水解乳清蛋白的水解工艺和水解物特性(水解度、分子质量分布和β-乳球蛋白抗原性),并利用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS) 比较了部分水解和深度水解工艺中过敏表位酶切位点的差异。研究结果表明,中性蛋白酶和碱性蛋白酶对羊乳清蛋白水解效果较好,其中碱性蛋白酶的水解度最高,达21.26%。经电泳分析,单酶水解后的产物中仍存在大分子多肽链,深度水解工艺需要复合酶水解。在酶底比为4000U/g时,使用碱性蛋白酶在pH值为10.0、温度为55℃条件下水解羊乳清蛋白1.0h,部分水解产物的水解度为12.31%,分子质量在5kDa以下的多肽占95.18%,β-乳球蛋白抗原性下降率为9.40%。中性蛋白酶和碱性蛋白酶的质量比为1∶1,酶底比为6000U/g,在pH值为8.5、温度为50℃条件下,水解羊乳清蛋白3.0h,深度水解产物的水解度为35.58%,分子质量低于3kDa的多肽为97.26%,β-乳球蛋白抗原性下降率为40.97%。部分水解和深度水解均能破坏β-乳球蛋白的大部分过敏表位,但相较于部分水解,深度水解能更大程度地降低乳清蛋白的致敏性。研究旨在为低致敏性羊水解乳清蛋白的生产提供一定的理论参考。     

超声波协同马克思克鲁维酵母Z17胞内粗酶处理降低乳清蛋白的致敏性

以超声预处理过的乳清蛋白为酶解底物,采用OPA法、ELISA分析等手段,探究马克思克鲁维酵母Z17粗酶水解乳清蛋白、降低乳清蛋白致敏性【以α-乳白蛋白(α-LA)和β-乳球蛋白(β-LG)为抗原性表征】的最优超声预处理-酶解条件。结果表明:乳清蛋白水解度受初始pH值和酶解温度的影响显著,α-LA、β-LG抗原性受初始pH值的影响显著,超声间歇时间和超声功率的交互作用对α-LA、β-LG抗原性影响显著。采用响应面法获得马克思克鲁维酵母Z17转化乳清蛋白的最优酶解条件是:超声间歇时间16 s,超声功率400 W,初始pH 6.16,酶解温度18.48℃,预测α-LA抗原性、β-LG抗原性的降低率达到最大值,分别为65.56%和57.96%。     

碱性蛋白酶水解乳清分离蛋白工艺优化

目的 降低乳清分离蛋白中的致敏蛋白含量, 制备低致敏性乳制品。方法 利用碱性蛋白酶水解乳清分离蛋白, 研究酶添加量、初始pH、酶解时间以及温度对乳清分离蛋白水解度的影响。在单因素的实验基础上, 采用Box-Behnken实验设计方法进行四因素三水平的响应面优化实验。结果 在P<0.05的水平下, 4个因素对乳清分离蛋白的水解度都有显著影响。最优的水解工艺为: 酶添加量6.4%、初始pH 11、酶解时间4 h、温度60 ℃。乳清分离蛋白在此条件下水解后, 水解度达到21.11%。酶解液的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析显示, 经过这一优化工艺水解, 10 kDa以上的蛋白基本全部被降解。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)分析酶解产物的多肽及蛋白质分子量分布, 结果显示酶解产物的分子量大都分布在3.5 kDa及以下。采用间接竞争酶联免疫吸附法原理测定2种标志性致敏蛋白(β-乳球蛋白和α-乳白蛋白)的残余抗原性, 发现2种致敏蛋白的残余抗原性也有不同程度的降低。结论 通过碱性蛋白酶水解后, 乳清分离蛋白中具有致敏性的大分子蛋白转变为小分子的肽类, 从而降低了致敏性。     

两步酶解法制备低致敏性乳清蛋白及其致敏性评价

目的 探究两步复合酶解工艺处理对牛乳清蛋白(whey protein isolate, WPI)结构和致敏性的影响。方法 实验采用邻苯二甲醛法、体积排阻色谱法分析WPI水解物在不同酶解时间下的水解程度,同时采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunoassay, ELISA)、细胞模型和小鼠模型对水解物进行体外和体内的致敏性评估,并利用超高效液相色谱-串联质谱法(ultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry,UPLC-MS/MS)分析水解物中的残留过敏原表位。结果 WPI经碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶顺序酶解3.0h后水解度达到14.19%,在水解2.0～3.0 h期间, WPI水解物主要由小肽(<5.0 kDa)组成。水解3.0 h后,水解产物与特异性抗体的结合能力降低了97.83%,细胞模型和小鼠模型结果证实,酶解产物的体外、体内致敏性显著降低,与空白对照组无显著性差异。UPLC-MS/MS结果表明WPI水解3.0 h产物中70.59%的肽段不含过敏原表位。结论 复合酶解工艺有效降低了WPI致...     

酶解对乳清蛋白抗原性影响的研究

研究了酶解对乳清蛋白抗原性的影响。选择了7种常见蛋白酶在同一水解模式下水解乳清蛋白，用竞争ELISA法测定水解物的残留抗原性，从而间接测定其过敏性变化。结果表明，酶解能有效降低乳蛋白抗原性，但水解物仍能与特异抗体反应，保留一部分抗原性。不同酶对乳清蛋白过敏原的影响不同，酶的特异性对乳清蛋白水解物的抗原性有较大的影响，碱性蛋白酶降低乳蛋白抗原性的效果最佳，对抗β-乳球蛋白（β-LG）和抗α-乳白蛋白（α-LA）抗体的抗原性分别降低了50．02％和99．72％。     

山羊乳与牛乳配方乳粉的致敏性比较

山羊乳是一类营养丰富且易于消化的乳品,因其营养成分与牛乳相近而受到广泛关注。本研究通过蛋白质潜在致敏性树状评估策略（生物信息学、消化稳定性、血清学研究、动物模型）对山羊乳配方乳粉的致敏性进行评价,并研究山羊乳配方乳粉与牛乳过敏患者血清中免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）E之间存在的交叉反应性。结果表明,山羊乳配方乳粉的167 种蛋白质中,β-乳球蛋白和α-乳清蛋白含量显著低于牛乳配方乳粉（P＜0.05）,山羊乳配方乳粉在模拟胃液中更易消化,且与过敏患者血清的结合能力弱于牛乳配方乳粉,动物模型结果表明山羊乳配方乳粉致敏小鼠体温下降幅度、临床过敏症状评分、血清中特异性IgE和IgG1抗体水平、血浆中组胺水平、血管渗透性及组织炎症程度等均显著低于牛乳配方乳粉组致敏小鼠（P＜0.05）,交叉反应性结果表明山羊乳配方乳粉能与牛乳过敏患者血清结合,但结合能力明显低于牛乳配方乳粉。结论：与牛乳配方乳粉相比,山羊乳配方乳粉的致敏性较弱,可作为牛乳的替代品,降低牛乳过敏性疾病的发病风险。