植物蛋白饮料中榛子成分环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法的建立

该研究基于植物蛋白饮料掺杂使假现象普遍,建立一种针对榛子成分为检测目标的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）快速检测技术方法。根据欧洲榛子染色体Ca8（登录号：LR899430.1）基因保守序列（第19517533 ~19519500 bp）,设计榛子成分环介导等温扩增检测特异性引物,构建反应体系,并验证方法的特异性、灵敏度和稳定性;以Real-Time PCR（Polymerase Chain Reaction）为对照方法,采用显著性差异检验（McNemar’s检验）方法,通过32种植物蛋白饮料检测结果验证LAMP方法的性能指标和准确性。该研究建立的LAMP方法特异性强,33种植物成分中除了榛子DNA外,其它植物成分DNA均未获得阳性扩增结果;重复性实验稳定性好（扩增Ct值,RSD=5.41%）,最低检出限为0.1%（以质量分数计）;通过植物蛋白饮料产品应用性验证,得出方法特异性和灵敏度均为100%,不存在假阳性和假阴性。综上,该研究建立的植物蛋白饮料榛子成分LAMP检测技术,具有操作简单、快速高效（从样品处理到最终结果可在2 h内完成）、准确度高等优点,可应用于植物蛋白饮料榛子成分快速检测。     

环介导等温扩增技术快速检测食品中变形杆菌的研究

采用环介导等温扩增(LAMP)技术,快速检测食品中的变形杆菌。以变形杆菌(CMCC49027)的atpD基因作为靶序列,设计内、外引物,通过肉眼观察白色沉淀,判断检测结果。共对11株致病菌进行特异性实验。结果表明,变形杆菌为阳性,其他10株菌为阴性。采用FTA滤膜制备模板进行LAMP反应,其方法的灵敏度为6.4×102CFU/mL。利用LAMP技术直接检测人工污染的肉制品中的变形杆菌,其检出限为3.6×103CFU/g。本实验所建立的快速检测变形杆菌的LAMP检测方法具有较高的特异性和敏感性,能够满足变形杆菌快速检测的需要。      

环介导等温扩增技术快速检测食品中变形杆菌的研究

采用环介导等温扩增(LAMP)技术,快速检测食品中的变形杆菌。以变形杆菌(CMCC49027)的atpD基因作为靶序列,设计内、外引物,通过肉眼观察白色沉淀,判断检测结果。共对11株致病菌进行特异性实验。结果表明,变形杆菌为阳性,其他10株菌为阴性。采用FTA滤膜制备模板进行LAMP反应,其方法的灵敏度为6.4×102CFU/mL。利用LAMP技术直接检测人工污染的肉制品中的变形杆菌,其检出限为3.6×103CFU/g。本实验所建立的快速检测变形杆菌的LAMP检测方法具有较高的特异性和敏感性,能够满足变形杆菌快速检测的需要。     

环介导等温扩增技术快速检测食品过敏原牡蛎成分

目的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)方法快速检测食品中的过敏原牡蛎成分。方法根据国家生物技术信息中心的牡蛎线粒体序列,通过Primer Explorer version 5.0软件设计引物并筛选出LAMP特异性扩增引物。并进一步对反应体系优化,对该方法的灵敏度、特异性以及稳定性进行验证。对10种牡蛎阳性样品、14种阴性样品、4类牡蛎相关食品进行检测。结果该方法可以检测出含牡蛎成分0.1%, DNA浓度为0.01 ng/μL的样品。在实验时间上大幅缩短,反应可在25～45 min内结束,并且可以在微量体系下完成,对于食品相关产品的检出率为100%。结论该方法操作简单、成本较低、特异性高、灵敏度好,适用于食品中过敏原牡蛎成分的检测。     

环介导等温扩增技术快速检测沙门菌

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下高特异、高效、快速地扩增靶序列的DNA扩增新技术.以沙门菌(Salmonella spp.)为研究对象,根据其特异性的invA基因,设计了一套特异性引物对该基因进行了LAMP,同时优化了其反应条件,建立了沙门菌的LAMP快速检测技术.结果表明,LAMP的最佳反应条件为外引物浓度5 pmol/L、内引物浓度40pmol/L,Mg2 浓度6mmol/L,dNTP浓度0.8mmol/L,甜菜碱浓度0.8mmol/L,Bst DNA聚合酶8u,反应温度63℃,反应时间1 h.在此条件下,LAMP检测沙门菌DNA的敏感度达10fg/反应,且与其他常见的细菌无交叉反应.其对牛奶样品的检出量为102cfu/mL,适合于食品中污染沙门菌的快速检测.     

环介导等温扩增技术快速检测变形杆菌属的研究

建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测变形杆菌属(Proteus)的方法——环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。通过对GenBank中变形杆菌属atpD基因序列(AX109601)进行分析,设计了6条引物(2条内引物、2条外引物、2条环引物),在Bst大片段聚合酶的作用下,对模板DNA进行梯状等温扩增,产生白色沉淀,并且优化LAMP的反应体系,检验其灵敏性与特异性。扩增产物用限制性内切酶Psp1406Ⅰ(AclⅠ)酶切,观察酶切片段大小,验证方法的正确性。结果表明,该方法在61℃保温50 min即可完成,最低检测限为5.4 CFU/mL,灵敏度高于常规PCR 10倍。对其它食品病原菌进行检测,结果均未出现目的条带。表明LAMP法检测变形杆菌属灵敏度高、特异性好,操作简便,无需特殊的仪器设备,有恒温加热设备就可以满足检测条件,极适合在我国广大基层实验室开展应用。     

环介导等温扩增技术在转基因成分检测中的应用

随着全球转基因作物商业化种植面积持续增长,转基因成分检测作为转基因作物安全管理的重要技术支撑受到越来越多的关注,世界各国与地区不断致力于转基因成分检测技术的开发。环介导等温扩增（loop-mediatedisothermal amplification,LAMP）技术由于简单快速等特点,近年来在转基因检测领域备受青睐。本文对LAMP技术在转基因成分检测中的最新研究与应用及其发展前景加以综述。     

环介导等温核酸扩增技术快速检测产毒亚历山大藻

DNA环介导等温扩增(LAMP)方法是一种新型的核酸扩增技术,该方法是在等温的条件下进行的,具有反应时间短、灵敏度高、特异性强的特点.本文以产麻痹性贝毒(PSP)的亚历山大藻为研究对象,采用简易法提取DNA模板,设计特异性LAMP引物,利用LAMP技术进行产毒藻种的快速检测,同时,着重对LAMP技术与PCR技术在检测微小亚历山大藻细胞的灵敏度方面做了比较.向LAMP终产物中加入SYBR Green I 染料后可直接用肉眼观察结果而不需要通过凝胶电泳来观察.结果表明,LAMP技术在恒温65℃,1h内就可以检测到产毒藻种;LAMP技术检测微小亚历山大藻的最低检测限为200个/ml,而PCR技术的最低检测限为1000个/ml,LAMP扩增方法比PCR扩增方法的程序简单、反应时间短、灵敏度高;LAMP技术不需要精密的温度循环装置,有恒温加热设备就可以满足检测条件,可用于野外检测.     

环介导等温扩增技术快速检测肉中金黄色葡萄球菌

应用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术建立了对肉中金黄色葡萄球菌检测的方法。实验中,使用了最新的Bst 2.0 Warm Start DNA聚合酶完成LAMP扩增反应,并针对金黄色葡萄球菌所特有的保守性耐热核酸酶基因（nuc）设计得到了一套LAMP扩增引物。对LAMP法和PCR法的检测灵敏度进行了比较,同时对人工污染肉中的金黄色葡萄球菌进行检测。结果表明：所建立的LAMP法能够特异性的检测金黄色葡萄球菌,并且检测金黄色葡萄球菌纯菌的灵敏度为2.01×10~0CFU/m L,是普通PCR检测灵敏度的100倍。在检测肉中金黄色葡萄球菌时,检测限为2.01×10~1CFU/m L。因此,本实验所建立的LAMP法检测肉中金黄色葡萄球菌的方法,具有灵敏、快速以及简便等的优点,是一种具有很好的发展前景的检测手段。     

应用环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌

建立环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌的方法,通过肉眼可见的白色沉淀,判断检测结果。将阪崎肠杆菌(ATCC29544)的16S-23SrRNA间区序列作为靶基因,设计2对特异引物,优化反应条件,进行LAMP扩增。对产物进行酶切分析,与理论上的预期结果相一致。通过测序比对,与GenBank上报道的同源性达到99%。用25株食源性致病菌证实该引物特异性强。LAMP扩增20min,其灵敏度为4.3×102 fg/tube,结果表明,LAMP方法检测阪崎肠杆菌,灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

环介导等温扩增技术检测酸奶中嗜酸乳杆菌

目的建立环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测酸奶中嗜酸乳杆菌。方法以嗜酸乳杆菌16S r RNA保守区的基因序列为靶序列设计引物,优化建立LAMP反应体系和程序,并研究引物的特异性,同时确定嗜酸乳杆菌的灵敏度和检出限。结果本方法可通过凝胶电泳和离心后焦磷酸镁白色沉淀检测反应结果,检测时间为5.5 h,灵敏度为62 CFU/m L,人工污染酸奶样品的检出限为120 CFU/m L,12株非嗜酸乳杆菌细菌非特异检测结果均为100%。结论该方法灵敏性好、特异性强、操作简单、耗时短,可适合于酸奶中的嗜酸乳杆菌的快速测定。     

可视化环介导等温扩增技术检测鸡鸭源性成分

目的建立生肉及熟肉制品中鸡、鸭源性成分的特异性基因LAMP可视化快速检测方法。方法根据鸡鸭物种特异性cytb、COX3基因的6个特异性区域设计LAMP引物,在反应前加入羟基萘酚蓝(HNB),在63℃条件下反应45 min;反应结果可以根据颜色变化直接判断,阳性为天蓝色,阴性为紫罗兰色。并对30个肉制品样品进行可视化LAMP和PCR方法平行检测。结果 LAMP方法的最低检出限为1 pg,特异性良好,同时对肉制品中目标物检测的检出限可达到0.01%。结论该方法用于肉制品中鸡鸭源性成分的快速检测,具有操作简单、无需贵重仪器、反应结果肉眼可观察、灵敏度高和特异性强等特点,适合于基层监管部门进行肉制品现场快速检测。     

环介导恒温扩增快速检测植物油中掺假地沟油方法的建立

以植物油中不应存在动物源性成分为鉴定依据,建立食用植物油中掺假地沟油的环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测方法,以动物线粒体DNA为检测靶标,根据脊椎动物线粒体基因组高度保守序列设计了两条外引物(F3、B3)和两条内引物(FIP、BIP),采用LAMP实时荧光法和染色法对扩增产物进行比较分析,对甜菜碱和Bst DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)量进行了优化,并进一步评价方法的特异性、灵敏度和稳定性。结果表明,在1.6 μmol/L内引物(FIP和BIP),0.2 μmol/L外引物(F3和B3),6 mmol/L MgSO₄,1.6 mmol/L dNTP,10×Thermo pol Buffer,8 U Bst DNA聚合酶,扩增温度为65℃,扩增时间为1 h的优化条件下,能够一次同时扩增出牛、羊、猪和鸡等脊椎动物DNA序列,检出植物油中最低含量为0.01 ng/μL的动物源性DNA,优化后的LAMP方法特异性好,仅能扩增出动物源性DNA序列、重复性好、稳定性高,可用于油脂中动物源性成分的检测,为油脂鉴伪和地沟油的鉴别提供一种稳定、高效、适应性强的现场快速检测技术。     

叠氮溴乙锭-环介导等温扩增法快速检测空肠弯曲菌活菌

目的建立叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide, EMA)-环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测空肠弯曲菌活菌的方法。方法以空肠弯曲菌mapA基因为检测靶基因,纯培养物提取模板进行LAMP反应,检测空肠弯曲菌LAMP灵敏度、EMA曝光照射时间试验和使用浓度试验。结果空肠弯曲菌LAMP检测灵敏度为800 CFU/mL;曝光照射时间为5 min; EMA终浓度50μg/mL以下时不会抑制空肠弯曲菌活菌的DNA扩增,终浓度为1μg/mLEMA能有效抑制4×10~4CFU/mL空肠弯曲菌死菌扩增; 1%活菌混合体系中EMA-LAMP检测结果为阳性。结论 EMA-LAMP方法能有效快速检测空肠弯曲菌活菌。     

环介导等温扩增技术快速检测椰毒假单胞菌的研究

建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测椰毒假单胞菌的方法.根据公布的椰毒假单胞菌16S～23SrRNA基因序列设计引物,建立了LAMP反应体系,在此基础上检测了蜡样芽孢杆菌菌液和人工污染蜡样芽孢杆菌的银耳样品,并将LAMP法与PCR法进行比较.结果表明,LAMP检测方法具有较高的特异性和敏感性,椰毒假单胞菌的检出限为5.4CFU/mL,是PCR方法检测灵敏度的1000倍,人工污染银耳样品中的椰毒假单胞菌的检出限为76CFU/g,样品中椰毒假单胞菌的检测过程(包括DNA提取、LAMP和电泳)可在2h内完成,因此LAMP可以简便快速有效地检测食品中的椰毒假单胞菌.     

Rapid detection of Listeria monocytogenes in raw milk with loop-mediated isothermal amplification and chemosensor

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) allows a rapid amplification of nucleic acids under isothermal conditions. It can be combined with a rhodamine-based dual chemosensor for much more efficient, field-friendly detection of Listeria monocytogenes. In this report, LAMP was performed at 63 °C for 10 min, followed by a rapid reaction of DNA amplification and the byproduct, pyrophosphate ion, with a rhodamine-based dual chemosensor and Cu(2+) is visualized as a disappearance of red color. The detection limit of L. monocytogenes by the LAMP-chemosensor was 8 to 10 cells per reaction tube, and the total assay time including 10 min for rapid DNA extraction was approximately 30 min. Data on naturally contaminated raw milk samples indicated that the LAMP method was highly specific and sensitive, giving 100% concordance with the ISO 10560 reference method. The results showed that the LAMP-chemosensor method has the advantages of better sensitivity and speed and less dependence on equipment than the standard Polymerase Chain Reaction for specifically detecting low levels of L. monocytogenes DNA, and this can be useful in the field as a routine diagnostic tool. PRACTICAL APPLICATION: The LAMP-chemosensor method reported here provided a powerful tool for detection of L. monocytogenes in raw milk samples due to its specificity, sensitivity, and rapidity.     

环介导等温扩增技术快速检测椰毒假单胞菌的研究

建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测椰毒假单胞菌的方法。根据公布的椰毒假单胞菌16S～23SrRNA基因序列设计引物,建立了LAMP反应体系,在此基础上检测了蜡样芽孢杆菌菌液和人工污染蜡样芽孢杆菌的银耳样品,并将LAMP法与PCR法进行比较。结果表明,LAMP检测方法具有较高的特异性和敏感性,椰毒假单胞菌的检出限为5.4CFU/mL,是PCR方法检测灵敏度的1000倍,人工污染银耳样品中的椰毒假单胞菌的检出限为76CFU/g,样品中椰毒假单胞菌的检测过程(包括DNA提取、LAMP和电泳)可在2h内完成,因此LAMP可以简便快速有效地检测食品中的椰毒假单胞菌。      

食品沙门氏菌环介导等温扩增技术应用研究进展

沙门氏菌引起的人畜共患疾病每年引发大量财产损失,快速简易的检验方法对于食品沙门氏菌的检验至关重要。环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）作为PCR的有力替代工具,经历多年发展已在等温扩增领域显示出明显优势,在沙门氏菌检测应用方面也日渐成熟。本文对近五年来LAMP技术在沙门氏菌检测中的应用和LAMP技术检测平台进行了分析汇总。在沙门氏菌LAMP技术的特异性方面,对现有靶标基因的有效性和新靶标基因的有效性进行了探讨,对不同血清型的特异性检测和多重LAMP的应用进行了总结,分析其优点与不足之处,以此说明探针法、多重检测,微流控技术和即时检测（Point-of-Care Testing, POCT）是沙门氏菌LAMP技术的未来发展方向,为LAMP技术更好地应用于沙门氏菌检测提供参考依据,对于提高食品中沙门氏菌的检验能力具有重要意义。