食源性致病菌核酸检测技术研究进展

近年来,食源性疾病的发病率逐年升高,已成为全球范围内的重大公共卫生问题。致病菌广泛存在于各种食品中,快速检测食源性致病菌,对提供安全的食物和预防食源性疾病具有重要的现实意义。由于传统食源性致病菌检测方法耗时耗力,因此建立食源性致病菌的快速检测技术尤为重要。食源性致病菌的核酸检测技术具有简便、耗时短、特异性强、灵敏度高等优点,已被广泛应用于食源性致病菌的检测。着重介绍近年来用于食源性致病菌检测的核酸检测技术,包括常规聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、多重聚合酶链式反应(multiplex-PCR,mPCR)、实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qPCR)、环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA),并对其优缺点,以及适用范围进行总结,旨在为开发出简单、快速、有效、准确的检测方法提供一定的理论依据。     

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipa H基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44 min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16 fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3 CFU/m L;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8 CFU/m L。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

实时荧光单引物等温扩增(SPIA)技术检测大肠杆菌O157的方法研究

建立一种快速、灵敏的食品中肠出血性大肠杆菌O157的检测方法。以大肠杆菌O157的特异性基因(rfbE)为靶序列,设计相应的RNA/DNA组合引物和链终止序列,优化引物浓度、Mg2+浓度、温度等反应条件,建立实时荧光单引物等温扩增(Real Time Fluorescence Single Primer Isothermal Amplification,实时荧光SPIA)检测大肠杆菌O157的方法,并对该方法的特异性、灵敏度以及人工污染检出限进行检测。确定了实时荧光SPIA法的最适反应条件,该方法可以在55 min内完成检测工作,除大肠杆菌O157外,其他细菌均未产生特异性荧光扩增曲线,而且实时荧光SPIA检测大肠杆菌O157的灵敏度为2.0 CFU/m L,对猪肉人工污染样品中大肠杆菌O157的检出限是4.0 CFU/g。实时荧光SPIA方法检测大肠杆菌O157具有耗时短,灵敏度高,特异性强,方法简便的优越性,为检测食源性致病菌构建了一个技术平台。     

食源性致病菌多重实时荧光PCR检测扩增内标的构建及评价

多重实时荧光PCR在食源性致病菌检测中具有重要的作用,扩增内标(IAC)可用来指示其检测过程中可能出现的假阴性检测结果。采用来源于人类腺病毒基因的一段序列设计IAC,并对其检测特异性、扩增效率以及与目的致病菌基因组DNA的抗干扰扩增能力进行了评估。结果表明,本IAC引物在供试菌株中均没有非特异性扩增结果,扩增效率达99.44%,而且对供试沙门氏菌(Salmonella spp.)、大肠杆菌O157:H7(Escherichiacoli O157:H7)以及单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的多重实时荧光PCR扩增没有任何干扰,在食源性致病菌多重检测技术的建立中具有广泛的应用前景。     

等温扩增技术在食源性致病菌检测中的应用进展

等温扩增技术是近年来迅速发展的一类核酸扩增技术。相比于PCR,该技术具有高特异性、高敏感性、简单、便捷及低成本的特点。目前,核酸等温扩增技术在感染性疾病的诊断、基因多态性分析、疫情防治等方面已经有广泛应用,也有文献报道了其在细菌、病毒等病原体检测方面的应用。食源性致病菌和环境中的病原体检测等领域中,等温扩增技术展现了广阔的应用潜力,有望发展成为食源性致病菌检测的重要方法。本文综合国内外文献报道,对环介导等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、切刻内切酶核酸恒温扩增、交叉引物等温扩增、链置换等温扩增、SmartAmp技术等一系列等温扩增技术的原理、特性及其在食源性致病菌检测中的应用情况做一综述,从而为该技术在食源性致病菌检测的实际应用中提供参考和依据。     

副溶血性弧菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立

以副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)gyr B基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增(Real-time fluorescence single primer isothermal amplification,实时荧光SPIA)检测副溶血性弧菌的方法。实时荧光SPIA在40 min反应时间内,对3株副溶血性弧菌和16株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA检测,结果表明除3株副溶血性弧菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌纯培养DNA的灵敏度为8.2 fg/μL,对副溶血性弧菌菌悬液的检测灵敏度为13.5 CFU/m L;对鳕鱼、海蟹、牡蛎和咸鸭蛋等4种模拟样品中副溶血性弧菌的检出限均为14.7 CFU/g。研究结果表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便。     

重组酶聚合酶等温扩增技术在食源性致病菌检测中的应用

食品安全是人类面对的重大问题,对食源性致病菌的检测也一直是各种研究关注的重点。基于聚合酶链式扩增（PCR）核酸检测方法虽然已克服传统微生物培养耗时长、准确度不高等缺点,成为目前应用最广的致病菌检测方法,但由于需要精确温度控制大大限制了其在现场检测中的应用。重组酶聚合酶等温扩增技术（RPA）,作为一种新兴等温扩增技术,在近十年来发展迅速。该技术打破PCR的壁垒,弥补热循环、需要昂贵仪器等不足,更加适用于资源有限的现场检测。本文总结了重组酶聚合酶等温扩增（RPA）反应机理、引物及探针的设计方法,全面论述RPA在食源性致病菌检测中的应用,概述RPA发展的热点问题并对RPA技术未来发展方向进行展望。     

CRISPR-Cas系统在食源性致病菌检测中的研究进展

食源性致病菌的快速检测对预防食源性疾病的爆发具有重要意义。成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR)及CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)构成的CRISPR/Cas系统已被广泛的应用于核酸检测,并在对食源性致病菌的检测中展现出快速、灵敏度高、特异性强等优势。本文介绍了CRISPR/Cas系统的原理、机制,总结了CRISPR/Cas系统与不同扩增方法和信号输出模式相结合在食源性致病菌检测中的应用,并讨论了这些检测方法存在的一些问题和挑战,最后对该技术的未来发展前景进行展望,旨在为食源性致病菌的快速检测提供新思路。     

多重荧光PCR快速检测食源性致病菌的研究进展

食源性疾病多由食源性致病菌引发,威胁个人健康及全球食品安全,因此寻找有效、可靠的食源性致病菌高通量检测方法对于确保食品安全具有重要意义。鉴于传统检测技术耗时长、效率低等问题,PCR等分子生物学技术应用于食用致病菌检测领域越来越广泛,本文在普及食用性致病菌知识的基础上,着重对多重荧光PCR技术原理及在食用性致病菌检测的应用进展进行综述,以期为控制由食用性致病菌引发的食品安全隐患提供理论参考。     

食源性致病菌活菌检测方法的应用现状及展望

传统的细胞培养方法是活体致病菌检测的"金标准",但往往程序繁杂、耗时长。该文主要论述基于核酸[荧光定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）和信使PCR检测法]及噬菌体（噬菌体扩增法、噬菌体扩增与PCR/qPCR结合法、免疫测定或酶测定法及电化学噬菌体生物传感器法）两类非细胞培养的活菌检测方法,并对其在食源性致病菌活菌检测方面的应用及未来发展前景进行讨论,特别是基于噬菌体的方法,与传统检测相比在检测速度、灵敏度和特异性方面具有关键优势。     

应用环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌

建立环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌的方法,通过肉眼可见的白色沉淀,判断检测结果。将阪崎肠杆菌(ATCC29544)的16S-23SrRNA间区序列作为靶基因,设计2对特异引物,优化反应条件,进行LAMP扩增。对产物进行酶切分析,与理论上的预期结果相一致。通过测序比对,与GenBank上报道的同源性达到99%。用25株食源性致病菌证实该引物特异性强。LAMP扩增20min,其灵敏度为4.3×102 fg/tube,结果表明,LAMP方法检测阪崎肠杆菌,灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

分子生物学技术在食源性致病菌检测中的 研究进展

食源性致病菌是导致食源性疾病的重要爆发根源之一。分子生物学检测技术因其敏感性强、特异性高、快速简便、省时省力等优点,在食源性致病菌的鉴定与检测中扮演着重要角色。本文系统阐述了利用分子生物学技术检测食源性致病菌的方法,包括多重PCR、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术、基因芯片、液相芯片和基因探针技术等,分析了目前国内外学者对于这些技术由单一检测向多重检测的突破,及实现快速、高通量检测食源性致病菌的应用研究成果,总结了各种检测技术的优缺点,旨在为未来更好地发展快速、高通量检测食源性致病菌的技术方法提供参考。     

乳品中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌快速检测的新体系

食源性致病菌污染是乳制品安全问题的重要隐患之一,乳品中常见的食源性致病菌有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌等。目前,乳品中致病菌的检测以培养法为主,但此类方法操作较为繁琐,且耗时长,不能满足检测的时效需求。本文探索了荧光定量PCR技术在快速检测乳品中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的应用,并进行了大量的验证试验和实际检测,形成了乳品中致病菌快速检测的新体系。该体系可以在24h内完成金黄色葡萄菌和沙门氏菌的增菌与检测,缩短了整体检测时间,降低了检测成本,为进一步改良乳品中致病菌快速检测提供了参考数据。     

环介导等温扩增技术快速检测食源性致病菌的研究进展

食品安全是全球关注的重大问题,而食源性致病菌是对食品安全的重要考验。食源性致病菌引发的食源性疾病,对人类的健康乃至生命都会产生威胁。控制食源性疾病爆发的最有效方法就是快速检测食源性致病菌。传统的标准检测方法耗费大量人力且用时长,错失控制食源性疾病的最佳时机,亟需快速检测食源性致病菌的方法。环介导等温扩增技术(LAMP)根据目标菌株的特异序列设计引物,利用Bst聚合酶在等温条件下将低水平基因迅速扩增到可检测水平。扩增过程中生成大量焦磷酸镁白色沉淀,肉眼即可判定扩增与否。自2000年该技术报道以来,因其所需设备简单,检测用时短、效率高,特异性强和成本低廉的特点广泛应用于食品微生物的快速检测中。本文概述了LAMP的基本原理,技术特点以及在食品微生物快速检测方面的应用和新发展。     

核酸法在食源性致病菌检测中的研究进展

食源性疾病是指通过摄食而进入人体的致病因素使人患上感染性或中毒性的疾病,主要是由食源性致病菌引起的,包括细菌、病毒和真菌。分析食物中存在的食源性致病菌对于食品安全和降低食源性疾病的发生至关重要。传统的以培养为基础的检测食源性致病菌的方法灵敏度低、检测周期长。本文介绍的基于核酸的检测方法克服了传统方法在检测和鉴定方面的限制,具有特异性强、灵敏度高、操作简单、检测周期短等特点。核酸法主要包括普通PCR法、多重PCR法、实时荧光PCR法、核酸依赖性扩增、环介导等温扩增和基因芯片技术等。本文主要概述了核酸法在国内外食源性致病菌检测中的应用情况,总结了其优势和不足,同时对核酸法的发展趋势进行了展望。     

多重PCR技术在食源性致病菌检测中应用的研究进展

食源性致病菌的多重PCR检测技术是指能够同时扩增得到同种或多种致病菌的不同基因片段的技术。因该技术特异、灵敏且分析效率高,现已被广泛应用于食源性致病菌的检测工作中。本文介绍了多重PCR在食源性致病菌检测中应用的研究近况,并对影响因素及存在的问题进行了阐述。     

阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)分子检测方法研究进展

阪崎肠杆菌(现克罗诺杆菌属)是一种重要的食源性条件致病菌,因其能通过污染婴幼儿配方食品导致严重的新生儿脑膜炎、菌血症和小肠结肠炎等疾病,而受到广泛的关注。其分子生物学检测方法克服了传统检测方法实验操作繁琐、耗时长等问题。目前常用的分子生物学方法主要有普通PCR、实时荧光定量PCR、环介导恒温扩增、探针方法等。     

等温扩增技术在食源性致病菌检测中的研究进展

食源性致病菌污染是影响食品质量安全的重要因素之一,加强食源性致病菌的检测力度对于保证食品安全以及预防食源性疾病至关重要。基于核酸的分子检测技术较传统的培养方法相比,更加快速、灵敏、高效。等温扩增技术以反应条件简单等优点逐渐替代变温扩增技术。该文简述了环介导等温扩增、链替代等温扩增、单引物等温扩增、滚环等温扩增以及跨越式滚环等温扩增5种技术的研究进展及其在食源性致病菌快速检测方面的应用,指出了等温扩增反应存在的共性问题,并提出解决措施。此外,还对这5种等温扩增技术进行比较分析,为食源性致病菌的现场快速检测与筛查提供参考依据。     

纳米材料在食源性致病菌检测中的应用

食品安全问题是国内外一直都密切关注的热点问题,与每个人的生活都息息相关,而食源性致病菌则是引发食品安全问题的主要因素之一。快速、准确的检测食源性致病菌是控制这类问题的关键所在。传统的检测方法存在耗时长,特异性和灵敏性较差等问题。而将纳米材料与传统食源性致病菌检测方法相结合,能够有效解决此类问题,极大程度地促进了致病菌检测的研究进展。文章就几种常见的纳米材料在食源性致病菌检测中的应用进行了综合评述并对其未来的研究方向进行了展望。     

食源性致病菌多重PCR快速检测研究进展

食品安全问题现在备受关注,食品中致病菌的污染造成的食物中毒事件时常发生,传统的食源性致病菌检测方法操作繁琐,耗时长,未能及时检验出食品中的致病菌,这些缺点限制了此方法的广泛应用。聚合酶链式反应（PCR）满足了快速检测致病菌的要求。本文主要介绍了多重PCR快速检测食源性致病菌的原理、特点、检测体系的组成及其应用。多重PCR具有特异性强、灵敏度高、操作简便、可同时检测多种致病菌的优点,同时多重PCR技术可结合荧光定量PCR、基因芯片技术等建立一个更加完善的体系。