pPIC3．5K／Thanatin-（G8S2）-PPA毕赤酵母表达载体的构建和表达

将掌叶半夏凝集素和死亡素的融合基因thanatin-linker-ppa定向连接到pPIC3．5K,构建酵母表达载体pPIC3．5K／Thanatin-（G8S2）-PPA并进行序列分析,经SalI单酶切线性化后电转化到GSll5毕赤酵母感受态细胞中,PCR鉴定后在含有G418抗性的YPD平板筛选高拷贝重组子。利用甲醇在BMMY培养基中诱导表达融合蛋白,经SDS-PAGE和Westernbloting分析显示获得分子量约31kD的融合蛋白,融合蛋白经纯化后MTT分析其抗肿瘤活性,结果显示融合蛋白具有显著的抗肿瘤效果。     

sCAR-PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

为获得腺病毒受体sCAR与掌叶半夏蛋白(PPA)的亚基B(PPAb)的融合蛋白,将PPAb基因克隆入已构建的原核表达载体pQE30-sCAR中,经PCR和测序鉴定正确的重组质粒pQE30-sCAR-PPAb,转化大肠杆菌M15后获得工程菌。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-PPAb。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在42 kD左右有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-PPAb能提高Ad-EGFP对Kasumi-1的感染效率。     

融合蛋白sCAR-TSP-1原核表达纯化及诱导白血病细胞K562凋亡的研究

根据thrombospondin-1(TSP-1)氨基酸序列(RFYVVMWK),以已有的腺病毒受体sCAR为模板,将8个氨基酸对应基因核苷酸通过PCR扩增于sCAR之后,得到sCAR-TSP-1,连接到表达载体pQE30上,转化大肠杆菌M15后获得工程茵。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-TSP-1。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE分析表明,有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-TSP-1对白血病细胞K562有明显凋亡作用。     

sCAR—PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

为获得腺病毒受体sCAR与掌叶半夏蛋白（PPA）的亚基B（PPAb）的融合蛋白,将PPA6基因克隆入已构建的原核表达载体pQE30-sCAR中,经PCR和测序鉴定正确的重组质粒pQE30-sCAR-PPAb,转化大肠杆菌M15后荻得工程茵。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-PPAb。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在42kD左右有一条明显的特异性蛋白条带。N时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-PPAb能提高Ad—EGFP对Kasumi-1的感染效率。     

融合蛋白sCAR—TSP-1原核表达纯化及诱导白血病细胞K562凋亡的研究

根据thrombospondin-1（TSP-1）氨基酸序列（RFYVVMWK）,以已有的腺病毒受体sCAR为模板,将8个氨基酸对应基因核苷酸通过PCR扩增于sCAR之后,得到sCAR—TSP-1,连接到表达载体pQE30上,转化大肠杆菌M15后获得工程菌。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-TSP-1。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE分析表明,有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-TSP-1对白血病细胞K562有明显凋亡作用。     

携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体的构建

为了构建携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体,筛选出能表达该融合蛋白的重组腺病毒,检测其表达融合蛋白的情况及抗肿瘤特征.首先,通过PCR将NKG2D的配体MICB的基因片段插入含有全长抗体Herceptin基因的5型腺病毒穿梭载体pDC339-Her中,获得载体pDC339-Her-MICB与腺病毒骨架载体pBHGlox△E1,3Cr重组,然后在293细胞内进行病毒包装得到非增殖型腺病毒Ad-Her-MICB,纯化后测病毒滴度.双抗体夹心ELISA和Western blot检测融合蛋白的表达情况;间接免疫荧光实验(IFA)检测融合蛋白的特异性.酶切后DNA电泳鉴定证实载体构建成功,重组病毒经PCR鉴定携带融合蛋白基因.融合蛋白的表达量为(623.25±38.62)ng/mL;Westhern blot显示:该融合蛋白与商品化的Herceptin抗体轻链重链比较,大小一致,浓度匹配;间接免疫荧光检测(IFA)显示了融合蛋白与HER-2过表达的卵巢癌细胞株SK-OV-3结合的特异性.结果表明:腺病毒Ad-Her-MICB携带Herceptin-NKG2D配体融合蛋白基因能在体外正常表达且与商品化的Herceptin生物学特性相似,为融合蛋白的抗肿瘤治疗奠定基础.     

补料分批培养大肠杆菌表达胸腺素α1融合蛋白

在摇瓶培养含有trymosin α1基因的重组pET32a质粒的工程菌BL21表达胸腺素α1融合蛋白的基础上，确定了分批发酵的基本培养条件．分别在B．Braun 5L自控发酵罐中进行了分批发酵和补料分批发酵，针对发酵过程中工程菌生长较旺盛而表达量小的情况，改变了培养方式．比较了不同的培养条件和方式下的工程菌的生长状况和融合蛋白的表达量，得到了高产量和高表达的培养条件：在培养过程中始终保持DO值〉30％，在对数生长期溶氧供给不足的情况下，提高搅拌速度到最大并适当补充纯氧；（2）限制性流加葡萄糖；（3）培养温度35℃，诱导表达温度30℃；（4）对数中期诱导，表达时间为4～5h；（5）在诱导前加入新鲜培养基，稀释发酵液一倍，并以稀释后的发酵液体积为准加入诱导剂．最终使菌体的干重达10g／L，融合蛋白表达量达23．25％．     

补料分批培养大肠杆菌表达胸腺素α1融合蛋白

在摇瓶培养含有trymosin α1基因的重组pET32a质粒的工程菌BL21表达胸腺素α1融合蛋白的基础上,确定了分批发酵的基本培养条件.分别在B.Braun 5 L 自控发酵罐中进行了分批发酵和补料分批发酵,针对发酵过程中工程菌生长较旺盛而表达量小的情况,改变了培养方式.比较了不同的培养条件和方式下的工程菌的生长状况和融合蛋白的表达量,得到了高产量和高表达的培养条件: 在培养过程中始终保持DO值＞30%,在对数生长期溶氧供给不足的情况下,提高搅拌速度到最大并适当补充纯氧;(2)限制性流加葡萄糖;(3)培养温度35 ℃,诱导表达温度30 ℃;(4)对数中期诱导,表达时间为4～5 h;(5)在诱导前加入新鲜培养基,稀释发酵液一倍,并以稀释后的发酵液体积为准加入诱导剂.最终使菌体的干重达10 g/L,融合蛋白表达量达23.25%.     

带信号肽DsbA-胸腺素α1融合蛋白的表达及其分离纯化

以构建好的人胸腺素α1基因工程菌为研究材料,研究影响DsbA-胸腺素α1融合蛋白分泌效率的因素,优化信号肽酶表达得到阻遏的培养条件,获得含带信号肽DsbA-胸腺素α1融合蛋白的菌体,破碎细胞后利用疏水层析与Ni2 螯合亲和层析进行目标蛋白分离纯化,获得较高纯度底物蛋白(信号肽DsbA-胸腺素α1融合蛋白,其分子量约为34 kD),为进一步研究及分离纯化DsbA信号肽酶创造条件.     

双靶向溶瘤腺病毒联合奥沙利铂对肿瘤细胞凋亡的研究

研究化疗药物奥沙利铂(Oxaliplatin)联合AdCN205-IL-24对人结肠癌细胞的体外杀伤作用。实验采用MTT法检测肿瘤特异性增殖腺病毒AdCN205-IL-24联合奥沙利铂对两种肿瘤细胞以及正常细胞增殖的抑制作用;Hoechest33342染色,在荧光显微镜对病毒联合化疗诱导的肿瘤细胞凋亡进行形态学观察。结果表明:AdCN205-IL-24联合奥沙利铂处理4 d后对结肠癌细胞株HT-29和SW620的增殖抑制率达到23.17%和22.98%,并且联合化疗并未增加对人正常细胞株L-02的毒性。     

不可逆电击穿肿瘤细胞的仿真研究

当作用于细胞膜的电压峰值达到某种阈值时,作用于细胞的脉冲电场会将细胞膜击穿,最终导致恶性肿瘤细胞死亡。为寻求不可逆电击穿技术最大程度杀伤肿瘤细胞以及对周围正常细胞影响程度最小的作用参数,基于COMSOL软件中有限元的仿真方法搭建了不同的模型,可以直观地观察任意时刻、不同参数脉冲电场作用下肿瘤细胞的击穿过程和损伤情况,为寻求最佳治疗效果提供了相关参考。此外,通过观察肿瘤细胞与正常细胞在相同作用条件下的损伤程度,实现了肿瘤细胞的定位,为电脉冲的作用位置选择提供了定量参考。     

鸡红细胞体外融合最适条件的研究

探讨快速、有效的细胞融合条件,以一龄公鸡红细胞为材料,聚乙二醇(MW=1500)为诱导剂,研究不同的细胞密度、不同温度、融合时间、CaCl2浓度等因素对细胞融合率的影响。结果显示:细胞密度为1.0×107/mL,39℃,与PEG作用10 min,CaCl2浓度为50 mmoL/mL时融合效果最好。     

肿瘤免疫微环境中免疫细胞间通讯景观探究

肿瘤免疫微环境(TIME)内细胞间通讯为肿瘤发生发展提供了重要的微环境,但目前单细胞相关研究多关注免疫细胞与肿瘤之间的通讯,对不同免疫细胞间的信号交流研究较少。由此收集11套CD45+细胞的单细胞测序数据,推测出TIME中不同免疫细胞间的信号通讯网络。结果发现,肿瘤样本中免疫细胞间的交流更加频繁与密切,进一步分析得到12条与肿瘤相关的差异信号通讯关系,主要包括各种趋化因子?趋化因子受体信号、白介素?白介素受体信号以及Notch通路信号。这些通讯信号关系及其下游转录因子与肿瘤发生发展密切相关。此外,发现部分关键转录因子与各种肿瘤的预后显著相关。最后,通过构建TIME中不同免疫细胞间存在的细胞间通讯全局景观,挖掘出肿瘤中特异及缺失的免疫细胞间通讯关系,为理解TIME中免疫系统调控及肿瘤发展机制提供了线索,也为肿瘤的临床诊疗研究提供了新的设计思路。     

金鱼比较生物试验法检测河鲀毒素的研究

针对餐饮业缺乏TTX监测手段的现状,以红色鸡泡眼金鱼为受试对象,得到其死亡时间与体重、注射剂量之间的关系表及回归方程,建立的TTX金鱼比较生物试验法可用于河豚熟制品的定性测定、概略定量和生产经营中的预防性监测,并具有价廉、快速和易操作的特点。     

二氯乙酸钠联合ONYX-015对结肠癌细胞株的杀伤性研究

研究小分子药物二氯乙酸钠(dichloroacetate,DCA)联合ONYX-015对人结肠癌细胞株的体外杀伤效果,实验采用MTT法检测DCA、ONYX-015以及二者联合对结肠癌细胞株HCT116、SW620、HT29以及人正常细胞株L02增殖的抑制作用;利用Hoechst 33342染色对联合处理的细胞进行凋亡形态学观察;通过结晶紫实验检测进一步证明联合用药对肿瘤细胞的杀伤情况。实验结果表明:DCA联合ONYX-015处理4d后对结肠癌细胞株HCT116、SW620的增殖抑制率达到75%,对HT29也达到近54%的杀伤效率,并且联合治疗并未增加对人正常细胞株L02的毒性。同时结晶紫实验也证明联合治疗对肿瘤细胞的杀伤力要强于用DCA或ONYX-015单独处理。     

携带11R穿膜肽-p53融合蛋白基因的溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用

p53是研究较为广泛的抑癌基因,可通过不同的途径来抑制或杀伤肿瘤细胞.为增强p53的抗瘤活性,将穿膜肽11R与p53的融合蛋白基因插入增殖型腺病毒载体中,在293细胞中经同源重组筛选获得重组溶瘤病毒SG7605-11R-p53;利用Western blot检测11R-p53的表达情况,TCID50方法测定病毒滴度;应用细胞活力检测实验(MTT)比较病毒杀伤肿瘤及正常细胞的效果.结果显示:SG7605-11R-p53所携带的11R-p53基因在所选细胞株中都能正确表达,与SG7605-p53、AD5-p53相比具有更好的杀伤肿瘤细胞的效果,显示了较强的抗肿瘤效应.说明SG7605-11R-p53是一种有潜力的治疗肿瘤的新型基因-病毒治疗系统.     

纳米金修饰的微柱型微流控芯片用于循环肿瘤细胞检测

设计并制作了微柱型聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片,并在通道表面组装纳米金,固定上皮细胞粘附因子(EpCAM)抗体后用于循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)检测。结果表明,纳米金成功组装在γ-氨丙基三乙氧基硅烷硅烷化的PDMS微柱表面,EpCAM抗体功能化的微流控芯片能有效捕获全血中的模型CTCs,当流速小于40μL/min时,捕获效率大于90%。建立一种简单廉价、捕获效率高的CTCs检测新方法,有望为全血中CTCs的分离提供新的策略。     

双站系统对监测低仰角固定航路目标的建模

利用几何分析的方法,针对低空固定航路目标的特点,建立了目标沿双基地系统基线中点方向运动的回波信号模型,并对模型的适用范围和精度进行了分析,为建立双站系统对低仰角固定航路目标的模糊函数及其监测性能分析提供了一条新思路.