不同类型连接肽对β-甘露聚糖酶AuMan5A酶学性质的影响

以柔性肽F(GGGGS)3或刚性肽R(EAAAK)3为连接肽,将海栖热胞菌27家族碳水化合物结合域(CBM27)与宇佐美曲霉5家族β-甘露聚糖酶(Au Man5A)的C末端融合,探讨不同类型连接肽对Au Man5A酶学性质的影响,获取具有优良酶学性质的融合酶。采用重叠PCR技术扩增融合酶基因Auman5A-F-cbm~27和Auman5A-R-cbm~27,分别将Auman5A和融合酶基因在毕赤酵母GS115中进行表达,分析表达产物reAuMan5A、reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C的酶学性质。结果表明:该3种β-甘露聚糖酶对角豆胶的K_m值分别为1.7、1.9和0.9 mg/mL。3种酶的最适温度T_(opt)分别为70、65和70℃;reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C在70℃的半衰期t_(1/2)~(70)分别为36 min和124 min,较reAuMan5A的(t_(1/2)~(70)=9 min)延长了3倍和12.8倍。reAuMan5A-R-C具有底物亲和力强、热稳定性高和pH稳定范围广等特点,在食品、饲料、医药和能源等领域有着巨大的应用潜力。     

热稳定性高β-甘露聚糖酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

为开发耐高温、热稳定性高的β-甘露聚糖酶,以魔芋胶为唯一碳源,采用透明圈法,从土壤中筛选产β-甘露聚糖酶的菌株;通过16S rDNA序列及分子发育树分析对菌株进行鉴定;采用DNS法测定β-甘露聚糖酶活性并对酶学性质进行研究。结果表明,该菌能够水解魔芋胶,水解圈D/d比值平均为1.67;鉴定该菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)KD-1;该菌所产β-甘露聚糖酶最适pH6.0,最适反应温度60℃;在pH5.0~9.0和60~80℃,酶的稳定性良好,60、70和80℃酶的半衰期(T1/2)分别为5.5、4.3和4.2 h;10 mmol/L的Cu2+和Mg2+明显促进β-甘露聚糖酶活性,而Mn2+明显抑制酶活性。本研究筛选到一株地衣芽孢杆菌KD-1,其所产β-甘露聚糖酶,高温下(如80℃)热稳定性高于目前报道的β-甘露聚糖酶。     

产黄青霉β-甘露聚糖酶的高效表达、性质及应用

将产黄青霉（Penicillium chrysogenum）来源的β-甘露聚糖酶（PcMan26A）在毕赤酵母中高效表达,经高密度发酵,发酵液酶活力达25 200 U/mL。该酶属于GH26家族,与黑曲霉（Aspergillus niger）CBS 513.88来源的β-甘露聚糖酶同源性最高（67.8%）,是一个新型β-甘露聚糖酶。PcMan26A的最适催化条件为pH 6.0和50?℃,在pH?4.0～8.0和45?℃下具有良好的稳定性。该酶对魔芋粉具有最高的比活力,为3?581.0?U/mg。进一步利用该酶水解魔芋粉得到魔芋甘露寡糖,产品得率为86.2%;经分析,其主要组分为聚合度大于4的甘露寡糖。该β-甘露聚糖酶适用于生产魔芋甘露寡糖,为魔芋甘露寡糖的酶法生产提供了更多的选择。     

米黑根毛霉甘露聚糖酶的定向进化、高效表达与应用

为提高米黑根毛霉甘露聚糖酶（RmMan5A）对魔芋粉的水解效率,利用定向进化技术对该酶进行分子改造,经两轮筛选获得了一个对甘露聚糖酶催化效率显著提升的突变体（RmMan5AM2）。该突变体的最适pH为7.0,最适温度为65 ℃,较野生型甘露聚糖酶提高了10 ℃。该突变体继承了野生型甘露聚糖酶的高比酶活力,对槐豆胶的比酶活力达10 371.4 U/mg。在最适条件下,该突变体对槐豆胶、魔芋粉和瓜尔胶的催化效率分别提高了37.4%、28.9%和34.4%。进一步将该突变体在毕赤酵母中进行高效表达,经过156 h高密度发酵,发酵液胞外酶活力达176 000 U/mL,是目前产甘露聚糖酶的最高水平。利用该突变体水解魔芋粉成功制备魔芋甘露寡糖,产物主要为聚合度2~6的甘露寡糖（相对峰面积>85%）,总得率为88.5%。该突变体具有优良的酶学性质,对魔芋粉的水解效率显著提升,在魔芋甘露寡糖的酶法制备中具有很大的应用潜力。     

黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的酶学特性

纯化的黑曲霉Aspergillus niger WM20-11所产的酸性β-甘露聚糖酶经Sephadex G-100凝胶过滤层析和SDS-PAGE分别测得相对分子质量为39 000和40 000;IEF-PAGE测得酶的等电点为4.0;最适作用pH值和温度分别为3.5和70℃;糖质量分数19.6%;Mg2 、Ca2 、Li 、Na 、K 对酶有激活作用,Pb2 、Co2 、Fe3 、Mn2 、Hg2 对酶有抑制作用;酶对角豆胶的Km和Vmax分别为66.7 g/L和333μmol/(min.mg);酶蛋白的氨基酸组成中Asp和Glu含量最高;HPLC分析角豆胶酶水解液的主要产物是低聚糖。     

β-甘露聚糖酶AuMan5Aloop/H321G在乳酸克鲁维酵母中的高效表达

为制备食品级β-甘露聚糖酶,将来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)的糖苷水解酶5家族β-甘露聚糖酶突变体基因(AuMan5A~(loop/H321G))克隆至表达质粒pKLAC1信号肽α-MF下游,构建重组表达质粒pKLAC1-AuMan5A~(loop/H321G),并电转化乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)GG799。采用半乳糖诱导表达和酶活性分析获得了高水平表达的重组β-甘露聚糖酶突变酶(reAuMan5A~(loop/H321G))的转化子GG799/AuMan5A~(loop/H321G),其产酶活力为54.9 U/mL。SDS-PAGE分析显示,reAuMan5A~(loop/H321G)的表观相对分子质量约为55 000。经YPG培养基初始pH、摇瓶装液量以及诱导剂的种类、初始质量浓度和添加方式的初步优化,GG799/AuMan5A~(loop/H321G)所产酶活力较工艺优化前提高了254.6%,从而实现了reAuMan5A~(loop/H321G)在乳酸克鲁维酵母中的高效表达。     

芽孢杆菌M-21产β-甘露聚糖酶发酵条件研究

从土壤中分离筛选出产β-甘露聚糖酶的芽孢杆菌(Bacillus sp.)M-21,通过单因素实验和正交优化实验,确定了其最佳发酵产酶条件。菌株的产酶最适培养基组成包括(g/L)碳源:瓜尔豆胶4,复合氮源:豆粉20、(NH4)2HPO45,其他无机盐组分:K2HPO4.3 H2O1、MgSO4.7 H2O 0.5、NaCl 0.5、CaCl20.1、FeSO4.7 H2O0.001。产酶最适培养条件:培养基初始pH8.0,接种量4%,装液量50 mL/250 mL三角瓶,32℃180 r/min振荡培养36 h。此条件下酶活力最高可达1 487 U/mL。     

嗜热甘露聚糖酶manBK基因密码子优化表达及在魔芋聚糖降解中的应用

依据密码子偏好性原则,对嗜热甘露聚糖酶manBK基因密码子进行优化,以提高嗜热甘露聚糖酶在毕赤酵母中表达量;并通过对该酶酶学性质的探究,探讨金属离子对酶稳定性影响及其在酶解魔芋甘露聚糖中的应用潜力。结果表明:嗜热甘露聚糖酶manBK基因优化后GC含量为40%～53%,平均值为47%,密码子适应指数(codon adaptationindex,CAI)为0.87,共有242个碱基进行优化,优化前后基因序列的一致性为76%。重组菌株在25℃条件下,诱导72 h发酵液中酶活力可达22 U/mL。甘露聚糖酶ManBK的最适反应温度为80℃,最适pH值为5.0,表观分子质量为45 kDa,动力学参数K_m值为1.40 mg/mL,V_(max)值为149.25μmol/(min·mg)。金属离子Fe3+、Ca~(2+)、Mg~(2+)和Zn~(2+)对该酶活性有促进作用,分别使酶活力提高了32%、52%、23%和459%,而金属离子K~+、Li~+、Mn~(2+)和Cu~(2+)对ManBK酶有不同程度的抑制作用。进一步分析发现,Zn~(2+)能提高该酶的热稳定性,使70℃条件下的半衰期延长了116 min。当酶底比为1∶1时,反应温度70℃,pH 5.0反应进行1.5 h,魔芋聚糖即可达到较合适的酶解,魔芋聚糖降解物的抗氧化性能增强了5.6倍左右,ManBK酶在魔芋聚糖降解中具有极强的应用潜力。本研究为ManBK酶的制备及在魔芋深加工行业中的应用提供了一定的理论支撑。     

枯草芽孢杆菌05表达β-甘露聚糖酶酶学性质的初步研究

从池塘淤泥中分离筛选出1株高产β-甘露聚糖酶的菌株(B. subtilis05),并对其酶学性质进行了初步研究。结果表明:酶最适温度为50℃;在4-45℃活性较稳定;β-甘露聚糖酶最适反应的酸碱度为pH8.0;Na+,K+显著地促进酶活性,NH4-抑制酶活性,Mg2+、Cu2+、Fe2+显著抑制酶活,Fe3+抑制最显著;培养10.5h后,发酵培养基的黏度为2.78Pa.s,12h后的黏度为1.55Pa.s。     

异甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

以pET-30(a)为表达载体,将来源于枯草芽孢杆菌K-6(Bacillus subtilis K-6)的异甘露聚糖酶基因(isoman K-6)在Escherichia coli BL21(DE3)中进行了表达。Isoman K-6登录号为HQ902141,基因全长为1083bp,共编码360个氨基酸,工程菌酶活为415.9U/mL,SDS-PAGE电泳表明,工程酶ISOMAN K-6分子量约为45000u,与预期分子量相符。经IDAHisBind树脂柱纯化的纯酶酶学性质研究表明,该重组酶为金属酶,Al3+和Ba2+对其有很强的激活作用,其最适反应温度为55℃、最适pH为6.0,且在pH4.5~7之间有着较好的稳定性,以槐豆胶为底物时,Vmax和Km分别为1.3U/mL和7.3mg/mL。     

高产β-甘露聚糖酶菌株的分离鉴定及酶学性质研究

通过初筛和复筛从魔芋种植基地土壤样品中分离筛选高产β-甘露聚糖酶菌株。通过形态学观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定,并对其产β-甘露聚糖酶酶学性质进行研究。结果表明,筛选出一株高产β-甘露聚糖酶的菌株,编号为HTGC-10,被鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株HTGC-10在30 ℃、180 r/min条件下液体发酵24 h后,发酵液β-甘露聚糖酶活力为61.75 U/mL。酶学性质的研究结果表明,该菌株所产酶的最适反应pH值为6.0,在中性偏酸环境下稳定性较好,属于偏酸性酶;最适反应温度为55 ℃,热稳定性相对较差;乙二胺四乙酸（EDTA）和金属离子Na+、K+、Mn2+、NH4+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+对酶活力均有不同程度的抑制作用,其中Cu2+对酶活力的抑制作用最显著。     

耐高温β-甘露聚糖酶基因的高效表达与水解魔芋精粉条件的优化

β-1,4-D-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)能够随机催化水解甘露聚糖和葡甘露聚糖等中的β-1,4-甘露聚糖苷键。魔芋(Amorphophallus konjac)精粉是葡甘露聚糖类物质,以之为原粉在甘露聚糖酶的作用下可制作益生元类低聚甘露糖。采用串联多拷贝表达盒的方式提高耐高温甘露聚糖酶的表达量,获得具有高产特性的菌株;探究甘露聚糖酶的酶学性质以及水解魔芋精粉制作低聚甘露糖的最适条件,为甘露聚糖酶的产业化及低聚甘露糖的酶法制备奠定基础。结果表明:该酶的最适温度为70℃,最适p H5.0;所获得的多拷贝菌株在14 L发酵罐下酶活可达10810 U/m L;在最适反应条件下,该酶可高效地将魔芋精粉水解为低聚甘露糖。     

定点突变改善β-甘露聚糖酶AuMan5A的酶学性质

基于糖苷水解酶5家族(GHF5)β-甘露聚糖酶一级、三维结构的比对和分析,对宇佐美曲霉GHF5β-甘露聚糖酶AuMan5A的关键位点氨基酸实施定点突变以获得酶学性质优良的突变酶AuMan5A~(G320D)。采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Gly~(320)的密码子GGT突变为Asp~(320)的GAC,构建出突变酶基因Auman5A~(G320D)。分别将Auman5A和Auman5A~(G320D)在毕赤酵母GS115中进行了表达,分析了表达产物AuMan5A和AuMan5A~(G320D)的酶学性质。结果表明:AuMan5A~(G320D)的最适温度Topt由突变前的65℃提升至70℃,在70℃的半衰期t_(1/2)~(70)由原酶的10 min延长至25 min;AuMan5A~(G320D)的比活性由突变前的351.2 U/mg提高到1 729.1 U/mg,其催化效率(k_(cat)/K_m)是原酶的9.3倍。将Gly~(320)突变为Asp~(320)不仅改善了AuMan5A的温度特性,而且显著提高了该酶的比活性和催化效率。     

甘露聚糖酶AfMan5A和RmMan134C的性质差异分析及对多糖的协同降解

分析烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HBHF5来源的GH5家族甘露聚糖酶AfMan5A和微孢根霉（Rhizopus microsporus）GZHF10来源的GH134家族甘露聚糖酶RmMan134C的酶学性质差异,探究两者协同降解多糖的潜力。结果表明两者酶学性质差异较大,AfMan5A的最适温度和pH值分别为60 ℃和6.0,而RmMan134C最适温度和pH值为35 ℃和5.0。金属离子Cu2＋、Zn2＋和Mn2＋均表现出对2 个酶活性的抑制,而Mg2＋、Fe3＋和Li＋可促进AfMan5A活性,却对RmMan134C活性表现出轻微抑制。甘露聚糖酶RmMan134C较AfMan5A底物谱广,两者最适底物均为魔芋葡甘露聚糖。进一步研究发现,两者并未对甘露聚糖类底物表现出协同效果,而是在微晶纤维素的降解中表现出较好的协同作用,协同系数为6.1。本研究分析了GH5和GH134家族甘露聚糖酶的性质差异及降解多糖的协同效果,为甘露聚糖酶的进一步应用推广提供一定的理论支持。     

酿造酱油米曲霉产中性蛋白酶提取与酶学性质研究

对米曲霉菌种F-81所产中性蛋白酶的提取及部分性质进行了研究.结果表明硫酸铵分级沉淀的饱和浓度范围为40%～80%;该中性蛋白酶的最适作用温度为 60 ℃,最适pH 值为 7.0.40 ℃下酶稳定性较好,60℃下处理 20 min,粗酶中几乎检测不到酶活力;中性蛋白酶pH 稳定范围为 6.0～8.0.Km值为2.84 mg/mL;最大反应速度Vmax为0.32 mg/(min·mL).Mg2 对酶活有激活作用,Cu2 、Fe3 、Zn2 、Mn2 不同程度抑制酶活性,其中Cu2 、Fe3 强烈抑制酶活性.     

β-甘露聚糖酶高产菌株的双重诱变育种

以实验室保藏的一株β-甘露聚糖酶产生菌黑曲霉(Aspergillus niger)LW-1为原始出发菌株,采用自然分离、微波与甲基磺酸乙酯(EMS)双重诱变,经平皿透明圈粗筛、摇瓶初筛和复筛以及斜面传代稳定性实验,获得了一株高产、稳产β-甘露聚糖酶的突变株WS-2007。结果表明,该突变株摇瓶液体发酵产β-甘露聚糖酶活性高达3261U/mL,为原始出发菌株(1027U/mL)的3.18倍。     

产低温脂肪酶深海菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

从鄂霍次克海域沉积物样品(lv39-06-06-04-18H)分离得到的150株低温细菌中筛选到菌株130产脂肪酶活性最高,其活性达到42 U/mL。对该菌株进行16S rRNA基因序列同源性和系统发育分析,结果表明菌株130属于芽孢杆菌属(Bacillus)。对其分泌脂肪酶的部分酶活特性进行研究,结果表明:酶的最适作用温度为35℃,0℃时保持33%的相对酶活力;对热敏感,60℃处理10 min仅残留30%酶活性;酶的最适pH范围在6.0~7.0。     

β-甘露聚糖酶产生菌的筛选和酶学性质研究

从土壤中分离筛选出5株产胞外β-甘露聚糖酶的菌株,其中DK3菌株的摇瓶培养液的酶活力达3.85U/mL。该酶水解葡甘露聚糖的最适温度为37℃,最适pH为6.0,pH稳定范围为5.0～9.0,在低于40℃的温度下基本稳定。Fe2+、Cu2+、EDTA和NH4+对该酶有抑制作用,Na+则有激活作用。     

产甘露聚糖酶海洋微生物的筛选及酶学性质研究

目的:筛选产甘露聚糖酶的海洋微生物。方法:采用2216E、海水-高氏一号和海水-PDA培养基对采集的微生物进行分离纯化,采用平板透明圈法对菌株进行初筛,并对初筛中HC值较大的菌株通过发酵测酶活复筛;采用16S r DNA序列分析,并结合细胞和菌落形态观察及部分生理生化试验,对菌株进行鉴定;利用硫酸铵盐析法制备粗酶液,研究甘露聚糖酶作用的酶学特性。结果:从台湾海峡采集的海水和海泥样品中,分离得到细菌467株,霉菌145株,放线菌10株,初筛得到64株有透明圈的菌株,复筛得到菌株B555,其酶活力最高为28.18 U/m L,经鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。菌株B555所产甘露聚糖酶的最适反应p H为7.0,且在p H 5.0~10.0时较稳定;最适反应温度为50~55℃,在55℃时半衰期约为150 min;1 mmol/L的金属离子Ni+、Co2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Na+、K+、Fe3+、Ba2对酶活力均有抑制作用。在55℃,p H 7.0条件下,该酶对槐豆胶和魔芋粉有很好的底物特异性,Km值分别为4.7和3.33 mg/m L,Vmax值分别为588.23和476.19μmol/(m L·min)。可应用于魔芋甘露低聚糖的酶法制备。     

产β-甘露聚糖酶的海洋微生物的筛选

以含有2%的NaCl培养基,从海泥、海水样品中用魔芋精粉为碳源,富集和分离产β-甘露聚糖酶的菌株,再经过平板水解圈初筛和发酵复筛得到稳定高产β-甘露聚糖酶的菌株L1。L1菌株的最佳生长条件包括:种龄12h、温度30℃,摇瓶装液量为100mL(250mL三角瓶),接种量为2%,摇床转速为160r/min,培养时间24h,β-甘露聚糖酶活力达到34.31U/mL。