13 种河豚鱼CO I基因部分DNA序列分析及在物种鉴定中的应用

应用CO I基因聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增通用引物,对福建省和海南省搜集的3?属13?种河豚鱼样品与9?个未知种名的河豚鱼样品的CO?I基因靶序列片段进行PCR扩增和测序,13?个已知物种样品的DNA序列提交基因库（GenBank）,取得相应的登录号。各物种CO I基因靶序列长度均为681 bp。应用DNAMAN V6软件对样品的DNA序列进行同源性比对分析,建立样品间系统关系同源树。基于CO I基因序列,供试13 个样品被划分为4?个类群组。群间的同源率为84%,群内同源率为90%～100%。根据序列同源性分析结果,9?个未知种名的样品被归类到2?个类群组中,判定这9?个样品为东方鲀属或腹刺鲀属,其中1?个样品（HNW2）为月腹刺鲀,4?个样品（HNW3、HNW4、FJW2、FJW5）为棕斑腹刺鲀,1?个样品（HNW1）为暗鳍腹刺鲀;3?个样品（FJW1、FJW3、FJW4）为横纹东方鲀。探讨基于DNA条形码技术的CO I基因靶序列片段在河豚鱼种属鉴别中应用的可能性。     

圆弧青霉脂肪酶基因序列的生物信息学分析

从圆弧青霉PG37中克隆了碱性脂肪酶(Lip I)基因,并采用生物信息学分析了PG37 Lip I基因携带的遗传信息.序列分析结果表明:Lip I DNA序列全长1 480 bp,不存在重复序列,含有5个内含子,5' 端存在TATA box和多个转录因子结合位点;cDNA序列全长1 128 bp,包含了转录起始位点、5' 和3' 非编码区及858 bp的开放阅读框架;Lip I编码区对TGC、GAC、TTC、CAC、AAG、AAC和TAC这7种密码子使用频率最高;比对Lip I基因与Pichia pastoris基因组中的密码子使用频率,其中有21个密码子使用频率的比值相差较大.     

茶树两品种多酚氧化酶基因克隆研究

本研究以已克隆的植物多酚氧化酶基因保守序列区域设计特异引物,用PCR扩增法从岭头单丛、福云6号两个茶树品种中克隆得到多酚氧化酶基因片段.这两个茶树品种该基因片段与其它植物多酚氧化酶基因有较高的同源性,与临海水古茶的同源性高达95%以上,并从多酚氧化酶基因片段的核苷酸和氨基酸序列水平上进行了品种间的亲缘关系、进化和分类的分子分析.     

干燥时间对枣多酚得率和抗氧化活性的影响

通过高效液相色谱法和体外抗氧化活性法研究了50℃热风干燥对狗头枣和冬枣多酚得率和体外抗氧化活性的影响。检测了粗多酚得率,没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、芦丁、肉桂酸和槲皮素含量,以及粗多酚清除DPPH·能力和总还原力的变化情况。结果表明,狗头枣多酚得率从9.205 mg/g(干燥0 h)下降到8.833 mg/g(干燥48 h),对应条件下新鲜冬枣多酚得率从32.188 mg/g下降到26.315 mg/g。干燥处理过程中,狗头枣中的9种单体酚总量随干燥时间延长而减少;冬枣中对应的单体酚总量随干燥时间延长呈先增加后减少趋势。体外抗氧化试验中,狗头枣和冬枣多酚的抗氧化能力分别在干燥24、12 h时高于各自组别中其他处理组,并且冬枣的抗氧化能力强于狗头枣。最终确定市面干制的狗头枣(干物质量为70.19%)直接用于多酚的提取,冬枣经50℃热风干燥(干物质量为80.36%)12 h后用于提取多酚。     

奶山羊乳腺组织中基因CCDC85B的克隆

克隆奶山羊乳腺中基因CCDC85B。从本实验室前期建立的基因文库中挑选出CCDC85B的17 bp标签,采用GLGI和RACE技术进行扩增,获得基因的全长。结果表明,扩增片段长度为1 282 bp序列,其中编码区为606 bp,编码202个氨基酸残基,BLAST比对结果显示,该序列与已知牛、人CCDC85B的同源性分别为100%和83%,证明此基因确为奶山羊乳腺组织中的CCDC85B,为该基因的进一步结构分析和功能研究奠定基础。     

产甘油假丝酵母烯醇化酶基因的克隆及序列分析

从产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)基因文库中分离了一个含烯醇化酶基因(CgENO1)的克隆子.插入片段全长2 456 bp,包含一段1 314 bp的没有内含子的蛋白质编码区,编码一个含438个氨基酸残基的多肽链,其氨基酸序列与来源于酿酒酵母的烯醇化酶相似性为74.3%.多重序列比对显示,产甘油假丝酵母烯醇化酶(CgENO1)含有酵母烯醇化酶全部保守区.对编码区上下游序列分析显示,克隆片段含有典型的酵母基因上下游调控区,是一个完整的酵母新基因.     

烟草NtRAX基因的克隆和序列分析

根据GenBank中拟南芥RAX基因序列, 在烟草EST数据库中进行Blastp检索, 获得与之同源性较高的蛋白质序列, 选取同源性最高的蛋白质序列所对应的核酸序列, 设计引物, 获得中间片段, 再运用中间片段设计引物, 应用RACE方法获得其5′和3′末端cDNA序列, 将获得的3段序列拼接, 结合全长克隆测序验证, 获得一个新的普通烟草基因, 将其命名为NtRAX(NCBI登录号为JQ228591)。NtRAX的cDNA全长为1112 bp, 5′端非编码区96 bp, 3′端非编码区62 bp, 编码区长度为954 bp, 编码317个氨基酸, 预测的分子量是35.42 KDa。对该基因进行序列分析和功能预测, 得出该基因属于MYB基因家族, 是具有转录激活活性的烟草腋芽分生组织形成的调控基因。     

油菜野芥细胞质雄性不育恢复基因候选片段的克隆

根据植物细胞质雄性不育恢复基因编码的PPR（pentatricopeptide repeat）蛋白的特点,结合拟南芥PPR基因簇相似序列,扩增油菜野芥细胞质雄性不育（Nsa CMS）基因组DNA,筛选出一对简并引物,在Nsa不育系育性恢复后的可育材料和野芥亲本中可以同时扩增出符合预期的片段。片段长度为309bp,与萝卜CMS恢复基因核苷酸序列的一致性为69%,与拟南芥1号染色体臂上PPR基因簇核苷酸序列的一致性大于70%,与含波里马（Pol）CMS恢复基因的白菜型油菜相关序列一致性达85%。该片段编码的氨基酸序列含有两个相邻排列的PPR基序,可作为Nsa CMS育性恢复基因的候选片段。     

烟草侧芽生长相关基因克隆及RNAi载体的构建转化

为了培育打顶后不长侧芽的烟草植株,通过同源克隆,在烟草(品种K326)中得到了与侧芽生长相关基因的1个片断,将该片段序列通过BLAST检索Genbank同源比对,发现该基因同番茄的LS基因有非常高的同源序列,另外与水稻的MOC基因、拟南芥的LAS基因也有一定的同源性,命名为TLR基因.将TLR基因阅读框内640 bp的正向和反向片断构建到RNAi载体pHANNIBAL内含子两侧,再经NotI酶切回收约4300 bp目的片段,并插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含TLR基因片段正反向重复序列的植物表达载体pHANNIB AL-TLR-P ART27.将pHANNIB AL-TLR-P ART27质粒导入根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,没有得到转基因再生植株,推测这与TLR基因表达被抑制有关.     

植物乳杆菌P8亚油酸异构酶基因及其上游非编码区的克隆与分析

依据GenBank中已公布的亚油酸异构酶基因,设计一对特异性引物,PCR扩增该基因后,克隆到T载体上并转化到Trans1-T1感受态细胞中。经菌落PCR鉴定和序列分析表明,亚油酸异构酶基因大小为1720bp。该基因与植物乳杆菌AS1.555(DQ227322)的同源性达到99%,与泡菜植物乳杆菌(DQ010331)的同源性达到89%。该基因序列在GenBank上注册,编号为HM569265,对其进行生物信息学分析发现,基因中含有一段低复杂性区域。分析乳酸杆菌(CP001617)基因组全序列,设计了亚油酸异构酶基因上游非编码区805bp片段的特异性引物,PCR扩增该片段后将其克隆到T载体上并转化到Trans1-T1感受态细胞中。经菌落PCR鉴定后,进行序列分析和生物信息学的初步分析,预测出该片段中有12个基序,以及6个转录调控元件。     

电子束辐照对不同成熟度番茄后熟及乙烯生成的影响

为明确电子束辐照对跃变型果蔬采后后熟和保鲜的影响,以不同成熟度番茄为试材,10Me V、10 kW电子直线加速器为射线源,采用不同剂量(0、0.4、1.0 kGy)电子束辐照新鲜采收的番茄果实,测定货架(20±1℃,50%RH,14 d)期间的果皮红色指数、乙烯释放量、ACC合成酶(ACS2)基因和ACC氧化酶(ACO1)基因的表达量及保鲜效果。结果表明,电子束辐照可抑制番茄果实货架期后的变红后熟,剂量越高,抑制程度越大,果皮红色指数越低。电子束辐照对14 d货架期间番茄果实的失重、皱缩、霉变无显著影响。电子束辐照对番茄果实乙烯释放量、ACC合成酶基因和ACC氧化酶基因表达量的影响因番茄果实成熟度不同而异。对成熟度低的绿熟期果实,电子束辐照可抑制其乙烯释放和ACC合成酶基因、ACC氧化酶基因的表达。对成熟度高的红熟期果实,电子束辐照可促进其乙烯释放,但乙烯合成关键酶基因表达量高低因电子束辐照剂量而异,1.0 kGy处理可抑制ACC合成酶基因、ACC氧化酶基因的表达。     

应用多重PCR检测食品中SARS病毒靶基因的初步研究

以分子生物学方法——聚合酶链式反应(PCR)技术为基础,初步探讨了食品中SARS病毒靶基因片段的多重PCR检测技术。根据GenBank公开发表的SARS病毒基因组cDNA序列,人工合成克隆特异性靶基因DNA片段,以此片段作为阳性对照,并将其添加到罐装蘑菇、牛肉干、大豆、鱼干等食品的cDNA中作为阳性样品,再根据世界卫生组织推荐的引物序列合成引物,进行单PCR与多重PCR检测分析。结果表明:以单PCR法获得了121bp、182bp及302bp3条靶基因片段;以二重PCR法获得了121bp+182bp、121bp+302bp与182bp+302bp的靶基因片段组合;以三重PCR法获得了121bp+182bp+302bp的靶基因片段组合。检测灵敏度的实验表明:182bp片段的模板DNA量在0.003ng以上时,单PCR都能扩出清晰的条带,而121bp的靶基因片段只有模板DNA量在0.03ng以上时,单PCR才能扩出清晰的条带。它们的二重PCR分析的灵敏度与相应的单PCR分析灵敏度相同。     

牛乳腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及序列分析

根据Genbank上公布的金黄色葡萄球菌肠毒素A的全序列,利用生物学软件Primer 5.0和oligo 6.0设计了一对特异性引物来扩增靶序列片段,经克隆预测序,结果表明扩增片段长度为101 bp,锦州分离株与标准菌株的基因片段序列相似性为100%,与Genbank上公布的金黄色葡萄球菌菌株(EF520720.1)SEA基因相似性达到99.14%。高度相似性结果为进一步研究建立分子检测技术奠定了实验基础。     

2种山葡萄白藜芦醇合酶基因的克隆与序列分析

目的:白藜芦醇合酶(resveratrol synthetic enzyme,RS)是植物白藜芦醇合成途径中的关键酶,为获得高效表达的白藜芦醇合酶基因,方法:利用已知的葡萄RS基因(AF274281)序列设计并合成一对引物,以2种不同来源的山葡萄叶片基因组DNA为模板,PCR扩增包含RS完整基因在内的一段序列;在此基础上采用悬挂延伸PCR法分别克隆目的基因。结果:测序与序列分析表明,RS全长基因片段大小均为1 536bp,其中包含一个内含子及两个外显子,同源性比较,其内含子碱基变化较大。悬挂延伸PCR法克隆获得的目的基因,开放读码框分别为1 170 bp和1 182bp,编码389/392个氨基酸残基,命名为CNRS1、CNRS3。同源性比较发现,CNRS1、CNRS3与已知葡萄RS基因序列的同源性分别为98%、97.5%。结论:以上结果证实CNRS1、CNRS3属葡萄RS基因家族成员,为今后进一步对该基因的研究与利用打下了基础。     

钝裂银莲花Actin基因片段的克隆与序列分析

提取钝裂银莲花叶片中的基因组DNA,用来克隆其Actin基因序列片段,为研究其生理功能及其他基因在钝裂银莲花中的表达和调控奠定基础。根据GenBan中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保守序列设计简并引物。以钝裂银莲花叶片总DNA为模板,利用RT—PCR技术获得了3个Actin基因片段。序列分析表明,3个Actin基因片段长为780bp,含有一段内含子,第一段外显子编码128个氨基酸,具有2个Actin基因的功能位点;与其他植物同源序列进行分析表明,其核苷酸序列同源性在81%-90％之间,氨基酸序列同源性在95％-100％之间。第二段外显子编码84个氨基酸,与其他植物同源性序列进行分析表明其氨基酸序列同源性在94％-99％之间。本研究中得到的3个基因序列是Actin基因的同源片段,分别命名为AOACTI,AOACT2,AOACT3。     

受PVY诱导的烟草NtERD1的基因分离与表达分析

通过抑制差减杂交和cDNA芯片法从受PVY诱导的烟草抑制差减杂交文库中筛选得到一段长为745 bp的基因EST片段,经Blast同源性比对分析,该序列与植物脱水诱导早期应答基因(ERD)在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。ORfinder分析表明,该序列包含一个492 bp的开放读码框,编码163个氨基酸。氨基酸Blastp比对显示,该氨基酸序列与其他植物脱水诱导早期应答蛋白具有很高的同源性。所以筛选得到的这个新基因属于烟草脱水诱导早期应答基因,被命名为NtERD1(GenBank登录号为GU144573)。实时荧光定量PCR分析表明,NtERD1在PVY接种早期上调表达,因此NtERD1受PVY侵染诱导,可能对烟草抗病毒具有重要作用。     

MPCR方法检测食品中的伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特氏菌

为建立一种同时检测食品中的伤寒沙门氏菌(ST)、金黄色葡萄球菌(SA)和单增李斯特氏菌(LM)的快速检测方法,分别针对伤寒沙门氏菌的鞭毛抗原基因H1-d、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、单增李斯特氏菌溶血素O上的hlyA基因设计引物,进行特异性和灵敏性实验,结果表明3条特异性扩增片段分别为458bp、279bp和243bp,经DNA测序证明其序列与模板被扩增片段一致。该方法操作简便、快速,具有良好的灵敏性和特异性。     

嗜虫书虱β-actin基因克隆及定量PCR方法的建立

旨在建立嗜虫书虱的实时荧光定量PCR分析方法,为嗜虫书虱基因的定量分析提供技术支持。利用RT-PCR方法,从嗜虫书虱体内克隆获得了β-actin基因cDNA片段(GenBank登录号:FJ041117),该基因片段长度为822 bp,编码273个氨基酸残基(从第3个碱基开始编码)。根据此β-actin基因的序列设计引物,建立了基于SYBR Green I染料技术的实时荧光定量PCR方法。建立的嗜虫书虱β-actin实时荧光定量PCR法扩增效率高、检测范围广、检测周期短,为β-actin作为内参基因进行嗜虫书虱功能基因的定量分析奠定了基础。     

分枝犁头霉WL511热稳定α-半乳糖苷酶基因克隆及序列分析

构建并筛选耐热分枝犁头霉cDNA文库获得639 bp热稳定α-半乳糖苷酶基因片段,并以5′-RACE和3-′RACE技术获得上下游片段1817 bp和1092 bp,拼接得α-半乳糖苷酶全长序列2228 bp,其完整开放读码框为2142 bp,编码713个氨基酸,G+C含量43%;产物预测等电点5.2,预测相对分子质量81000。该基因(GenBank No.DQ234280)属α-半乳糖苷酶36家族,与其他来源的α-半乳糖苷酶基因同源性较低,与链霉菌Streptomyces avermitilis MA-4680的α-半乳糖苷酶同源性最高为38%。