定向进化在工业催化中的应用

酶和完整细胞的定向进化是一种提高它们催化性能的有效方法。近来的研究主要在新的酶功能的创造和一些新的有效的定向进化方法的建立。定向进化和理性设计相结合将加速用于制药、化学和食品工业的生物催化剂的发展     

酶立体选择性的定向进化策略

酶立体选择性定向进化的基本方法是用合适的分子生物学手段使酶基因发生随机突变,然后进行基因表达和高通量筛选。本文主要对引入突变技术和高通量筛选方法做一简要综述。     

利用工程酶改进有机合成的研究进展

修饰酶用于有机合成已经涉及了许多领域。它包括改变酶反应机制来催化新的反应,改变底物专一性、扩大底物专一性、改善底物专一性,例如动力学拆分中的对映选择性。酶修饰可以通过理性设计或随机突变方法来实现,前者需要知道酶的结构,后者则需要进行筛选。两种策略的酶工程都能成功,并且对于改进在催化中应用的酶非常有意义。最近,有例子表明这两种策略已经应用于许多酶中。     

理性设计提高β-葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性

采用同源序列比对策略和脯氨酸效应的设计策略,以同源建模的三维结构为基础,结合定点突变技术,对重组产紫青霉β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)进行理性设计,获得了2个热稳定性明显提高的突变体PGUS-E I130V和PGUS-E G280P,再将突变位点进行组合获得突变体PGUS-E I130V+G280P。相比PGUS-E,PGUS-E I130V、PGUS-E G280P和PGUS-E I130V+G280P在60℃下的半衰期T1/2分别比原始酶的23 min提高3.5倍,5倍和5.5倍,达到82 min,117 min和128min。突变体的动力学参数Kcat/Km值分别为1.534×107 mol-1·L·min-1,1.368×107mol-1·L·min-1和1.283×107 mol-1·L·min-1,与原始酶(1.316×107 mol-1·L·min-1)接近,对底物的亲和力基本不变。结果表明在蛋白质构象不稳定的区段中引入脯氨酸,以及在相应位置引入嗜热菌的氨基酸,均可提高蛋白质热稳定性。     

氨基酸突变对细胞色素P450 BM-3羟基化吲哚能力的影响

利用饱和定点突变技术对细胞色素P450 BM-3（A74G/F87V/L188Q）（PT）的168和435氨基酸位点分别进行随机突变,根据其羟基化吲哚生成的靛蓝在670nm处具有特殊吸收峰进行高通量筛选,获得了三个高于亲本酶（PT）的突变酶D168H、D168L和E435T。通过考察突变酶反应动力学参数、电子耦合率、热稳定性、最适pH以及区域专一性的变化情况,发现相对亲本酶而言所有的突变酶对底物吲哚的亲和力和催化效率都得到了不同程度的提高,其中突变酶D168H的kcat值比亲本酶提高了3倍多;突变酶D168H的电子耦合率比亲本酶大约降低了2倍,而突变酶D168L和E435T的电子耦合率却有轻微的提高;所有突变酶均在pH8.2附近表现出最大羟基化吲哚生产靛蓝的能力;突变酶D168H对吲哚的区域选择性得到了提高,主产物靛蓝从亲本酶的72%提高到了93%。另外,热稳定性实验表明：尽管突变酶D168H和D168L的热稳定性较亲本酶有所降低,但活力的大幅度提高并未对酶的热稳定性造成大的伤害。以上所有的结果为了解细胞色素P450 BM-3结构与功能关系提供了有用的信息,同时为进一步定向进化P450BM-3提高其功能特性提供了进化模板。     

细胞色素P450 BM-3羟基化吲哚能力的半理性改造

为进一步改造细胞色素P450 BM-3酶对吲哚的羟基化能力,以P450 BM-3结构与功能关系的推测为指导,选择突变酶P450 BM-3 （A74G/F87V/L188Q/E435T）为父本,在可能影响P450 BM-3催化吲哚羟基化区域选择性的D168位点进行定点饱和突变,根据全细胞催化产物颜色及组成进行筛选,得到了产物组成、酶动力学性质与父本不同的两个突变酶。突变酶D168W的吲哚羟基化产物中90%是靛玉红,而另一个突变酶D168R的产物中87%是靛蓝,产物组成均不同于亲本。在催化吲哚羟基化时,D168W的k_cat与父本相当,但K_m却是父本的4.8倍,催化活力只有父本的20%;而D168R的k_cat是父本的1.9倍,K_m是父本的82%,催化活力比父本提高了1.37倍。结果表明,在E435T突变上叠加D168位氨基酸残基突变对酶的催化性质产生了单一位点突变所不具有的协同效应,对酶催化的区域选择性和催化活力都有显著影响,以致改变了催化产物组成。这种基于知识的半理性定向进化方法由于是在关键位点进行突变,因此突变目的性强、突变效果显著。     

β-1,4-葡聚糖内切酶的定向进化

根据阳性转化子在IPTG诱导下可以在LB-CMC平板上产生水解圈的原理,在初筛和摇瓶复筛的基础上,采用易错PCR法对β-1,4-葡聚糖内切酶基因进行定向进化,从阳性转化子中筛选酶活提高的突变菌株.突变酶活性是野生酶的1.32倍,催化效率约为野生酶的1.26倍.基因测序结果表明,突变酶基因DNA序列中有3个碱基发生了突变...     

糖基化改造β-葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性

以N-糖基化提高毕赤酵母重组表达β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-P)的热稳定性为目的,在PGUS-P模拟结构分析的基础上,半理性方法设计并通过定点突变引入具有EAS(enhanced aromatic sequence)序列特征的新N-糖基化位点,经毕赤酵母重组表达后,获得了3个新糖基化的突变酶PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259。反应动力学分析表明,与原始PGUS-P相比,突变酶PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259催化甘草酸水解的Km变小,Kcat/Km增加,表明其对底物甘草酸的亲和力和催化效率均得到提高。热稳定性分析表明,PGUS-P-35和PGUS-P-259的热稳定性得到改善,在65℃下保温90 min,其热稳定性相对PGUS-P分别提高了13%和11%。研究表明在蛋白质的合适位点引入糖基修饰对提高蛋白的热稳定性具有促进作用。     

耐热木聚糖酶研究进展

木聚糖是自然界中含量第二丰富的多糖,是一种可再生资源,木聚糖酶能够降解木聚糖,被广泛应用于化工、食品、饲料、造纸、废物处理和制药等工业领域。大多数天然木聚糖酶热稳定性较差,利用基因工程和蛋白质工程手段对木聚糖酶进行改造,使木聚糖酶热稳定性提高,对工业生产有着重要的现实意义。在分析耐热木聚糖酶结构特点的基础上,对提高木聚糖酶热稳定性的技术手段的研究进展进行了综述,包括固定化、定向进化、半理性设计、理性设计、构建嵌合体,为拓宽耐热木聚糖酶的应用范围提供了帮助。     

草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟

以来源于草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的酪氨酸酚裂解酶(Eh-TPL)为目的基因,通过易错PCR定向进化技术构建突变体文库,利用高通量筛选方法获得了比酶活提高的突变体S20C和E202R,再通过定点突变得到突变体S20C/E202R/N161S。经摇瓶发酵培养发现,突变体S20C/E202R/N161S比野生型Eh-TPL的比酶活提高了30.61%;酶学性质研究结果表明,突变体S20C/E202R/N161S的最适温度仍为37℃,最适pH值从8.2升至8.5,热稳定性、pH稳定性均得到明显提高;结构模拟结果表明,突变体S20C/E202R/N161S的三维结构无明显变化,突变位点附近氢键和表面电势有所变化。体外定向进化技术能有效提高Eh-TPL的催化效率,对酶法生产L-酪氨酸具有重要应用价值。     

酶分子稳定性改造研究进展

酶催化转化在食品、医药和精细化工等领域起着越来越重要的作用。然而,目前大多数酶反应需要在较温和的条件下进行以维持其正常活性,而在实际应用的逆境中(如高热、高酸、高盐等),酶的耐受性却较差、容易失活从而导致反应效率下降,极大地限制了其推广和应用。因此,对酶分子进行抗逆改造以提高其稳定性和催化活性,是当前研究的热点也是难点。本文从化学修饰和分子改造两个方面总结了酶分子稳定性改造的新进展,从定向进化、半理性设计、理性设计和糖基化修饰4个角度重点阐述了分子改造提高酶稳定性的方法,重点介绍了糖基化作为一种新的酶分子稳定性改造技术的思路。     

通过定向进化策略提高酯酶立体选择性的研究

对菌株Rhodobacter sphaeroides的RSP-2728酯酶基因进行立体选择性定向进化研究,建立了有效的定向进化策略,以及通过扁桃酸甲酯水解反应所产生的酸根离子浓度来监测酶活的高通量筛选方法.利用易错PCR技术,进行了三轮突变,获得了突变株A6A5,B7F11和C8G1,对映体选择性(E值)从3.13分别...     

底物特异性的生物催化与酶设计改造

随着生物产业的发展,生物酶催化发挥着越来越重要的作用。然而,部分酶在应用过程中仍然存在诸多问题,影响了生物催化的进一步发展。本文以酶的底物特异性为切入点,回顾了酶的专一性、高效性和环保性;介绍了酶在药物合成和天然产物改性领域的应用以及所遇到的问题;综述了酶的底物特异性改造过程中各种方法的应用,包括化学修饰、非理性和理性设计。化学修饰作为一种直观的修饰方法,通过化学反应对酶分子进行改造;非理性设计是利用易错PCR和DNA Shuffling等手段获得底物特异性提高的突变体;理性设计是基于序列和结构信息对酶分子进行改造。本文从重塑活性口袋提高酶的底物特异性和重塑活性口袋改变酶促反应类型两个方面出发,详述了理性设计改变酶的底物特异性的方法,为酶的特异性改造提供借鉴。     

分子生物学技术在纤维素酶改造中的应用

纤维素是地球上数量最大的可再生资源,利用纤维素酶将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料,对于人类社会解决能源危机、食物短缺和环境污染具有重大的现实意义.作者介绍了纤维素酶分子特性及作用机理,综述了近年来基因克隆、理性设计和定向进化等分子生物学技术在纤维素酶改造方面的研究进展.     

酶定向进化技术及其在化学品生物转化中的应用

定向进化可有目的地按照需要改造蛋白质分子中的氨基酸残基或结构域,从而定向改造蛋白质的性质,使其成为具有人们预期功能的新型蛋白质,应用于不同化学品生物转化反应中。本文简要的介绍了酶定向进化技术及其在化学品生物转化中的应用。     

定向进化:选择今天的生物催化剂

定向进化可以创建突变文库,应用极其广泛,主要运用于生物催化和研究两个方面。本文涉及到新的突变和最新发现的基因重组方法,并给出了创建更加专一的突变文库新方法的全部概要,举出了在定向进化方法上挑选的典型例子,其中包括β-内酰胺酰基转移酶在内的一些成功的实验。     

细胞色素P450BM-3热稳定性的半理性改造

为了提高细胞色素单加氧酶P450 BM-3的热稳定性,采用半理性设计策略对该酶进行了分子改造。首先采用B-FITTER软件分析了P450 BM-3晶体结构中各氨基酸残基位点的温度因子(B-factor),识别出了一个对酶的热稳定性有不利影响的关键氨基酸残基位点G46,然后以P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G)为亲本酶在该位点进行定点饱和突变构建了突变文库,并从饱和突变文库中筛选获得了一个热稳定性得到显著提高的突变酶P450BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G/G46S)。该突变酶(G46S)的半失活温度(T5010)比亲本酶提高了5℃(达到48℃;在50℃的半衰期t1/2比亲本酶延长了一倍。同时,突变酶的酶学性质也得到明显改善,与亲本相比,突变酶Km降低了22%,kcat提高了90%,催化效率kcat/Km(67.42 L?(mmol?min)-1)比亲本提高了1.48倍。这说明G46位点不仅影响酶的热稳定性,还影响酶对底物的结合与催化性能。G46S突变酶的获得表明,只要采用适当的半理性设计策略对正确的位点进行分子改造,可以在提高酶的热稳定性的同时,保持或甚至提高酶的催化活性。     

酶工程：从人工设计到人工智能

计算机在酶工程中的应用使得酶的序列空间探索度不断被扩大。随着不同分子力场参数的建立,涌现出诸多以计算分子能量为基础的算法,并被用于酶的催化活性、稳定性、底物特异性等的改造与筛选。伴随计算机硬件的提升与算法的优化,从头设计全新功能的人工酶取得成功并得以发展。近年来,人工智能在蛋白质结构预测上不断获得突破,同时也被应用到酶的设计中。介绍了分子力场基础和酶设计与筛选的算法,重点阐述了从头设计的方法和成功案例,以及机器学习设计酶的流程和最新的研究进展,展望了人工智能在酶工程领域的未来发展,为酶的改造与全新功能的生物催化剂的设计助力。     

手性反应控制进展

现在越来越多的方法应用到用酶高效催化手性非外消旋化合物的对映性选择反应中来.对于不对称性合成反应或者动力学拆分的替代反应有动态动力学拆分、去消旋化和对映会聚转化等.另外,人们对影响反应生成的立体化学产物的参数(如溶剂、底物设计、固定化、定向进化等)有了进一步的了解.     

定点突变提高细胞色素P450 BM-3吲哚羟基化能力

为进一步提高细胞色素P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)对吲哚的羟基化能力,根据酶结构与功能的关系,以突变酶E435T为基础,在168位点引入D168L突变,获得了吲哚羟基化能力得到显著提高的突变酶D168L/E435T。突变酶对吲哚的K_m为1.72 mmol·L^-1(父本2.09 mmol·L^-1),转化数(k_cat)为28.15 min^-1(父本4.04 min^-1),表明D168L定点突变可以略微提高酶对底物的亲和力,但主要的效应是促进了底物的转化速率,这两个效应的综合表现是使酶的催化效率(k_cat K_m^-1)比父本酶提高了8.48倍。此外,产物中副产物靛玉红的比例也降低为1.2%(父本7.3%),这说明该突变酶催化吲哚的区域选择性上也更有利于靛蓝的生成。