α/β值与肿瘤细胞辐射敏感性及肿瘤细胞分次照射生物学效应研究

为考察恶性肿瘤细胞的分次照射效应,选取5种具有高辐射抗性的恶性肿瘤细胞系分别进行单次和分次的γ射线照射,比较它们的剂量存活曲线的α/β值及D50、D10值。结果表明,D50的分次照射效应的高-低排列次序为：SMMC-7721、HeLa、A549、HT29和PC3细胞,D10的分次照射效应的高．低排列次序为：SMMC-7721、HeLa、PC3细胞、A549和HT29细胞。5种肿瘤细胞的α/β值的低．高排列次序为：SMMC-7721、PC3、HeLa、A549和HT29细胞;除PC3细胞外,其余四种细胞的辐射敏感性和分次效应均与α/β值相关,α/β值越小,细胞越不敏感且分次效应越明显。不同组织来源的肿瘤细胞的辐射敏感性差异较大,其修复功能和分次照射的生物学效应也有相应的差异,部分肿瘤细胞的辐射敏感性和分次照射的生物学效应与其修复能力相关,单次照射剂量存活曲线的参数α/β值可作为检测肿瘤细胞的辐射敏感性和分次照射的生物学效应的标准。     

12C6+离子束照射不同肿瘤细胞显示重离子治疗癌症的明显优势

通过观察两种人恶性肿瘤细胞(人肝癌细胞SMMC-7721和人黑色素瘤细胞A375)对高LET12C6 离子和γ射线辐照的敏感性及其差异,考察重离子治疗肿瘤的可行性及优势.以这两种体外培养的来源于人体不同组织的具有高辐射抗性的恶性肿瘤细胞为实验对象,分别进行12C6 和γ射线0-6Gy内不同剂量点的单次和分次照射,采用克隆存活法统计细胞的存活分数.结果显示,无论是单次还是分次照射,12C6 照射后两种细胞的存活分数均明显低于γ射线照射,而且两种细胞的辐射敏感性差异明显降低,同时分次照射细胞的存活分数没有明显提高.结果表明,高LET重离子照射对肿瘤细胞能明显提高杀伤能力,同时降低了不同细胞辐射敏感性的差异且导致细胞低的修复.以上特点与重离子剂量深度分布相结合,使得重离子在治疗肿瘤时具有特殊的优势.     

X射线辐照后人肝细胞、肝癌细胞存活与端粒酶活性关系的研究

利用X射线对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721和正常人肝细胞HL-7702进行辐照,以细胞克隆形成法测定细胞存活率,多聚酶链式反应银染端粒重复序列扩增法(Telomeric repeat amplification protocol,TRAP-PCR)检测细胞中端粒酶活性变化,探讨辐照后细胞存活与细胞中端粒酶活性变化的关系。结果表明,SMMC-7721和HL-7702细胞的存活率都随辐照剂量的增加而相应降低。在1-4Gy剂量范围内,两种细胞的端粒酶活性变化均呈剂量依赖性增强。但在1Gy、2Gy、3Gy剂量下,SMMC-7721其端粒酶活性较对照(0Gy)细胞低;当辐照剂量达4Gy时,端粒酶活性略高于对照细胞。在1-4Gy剂量范围内,HL-7702和SMMC-7721的细胞存活与端粒酶活性在变化趋势上呈负的关系。     

重离子照射肿瘤细胞的相对生物学效应值

对人肝癌细胞SMMC-7721细胞和黑色素瘤细胞A375细胞,进行80.55MeV 12C6 离子、X射线和γ射线照射,通过克隆存活实验获剂量-存活曲线,以X射线或γ射线为标准,计算重离子的相对生物学效应(Relative biological effectiveness,RBE ).结果显示,两种细胞的重离子RBE值都大于1,且分次照射的RBE大于单次照射.重离子照射SMMC-7721细胞的RBE高于A375细胞,分次照射的差异更明显.重离子具有独特的物理特性及高传能线密度(Line energy transfer,LET)下的强杀伤作用,可有效杀伤不同肿瘤细胞,减弱了细胞间的敏感性差异.临床的分次照射重离子治疗时,细胞的亚致死修复明显降低,可采取较少的照射次数达到杀伤肿瘤的目的,提高肿瘤治疗效率,减轻病人痛苦.     

低剂量X射线照射诱导HeLa细胞存活的

采用集落形成法观察了低剂量X射线照射HeLa细胞的存活率，结果表明，小于0．5Gy的X射线照射细胞的存活率高于对照，得到了HeLa细胞存活的“兴奋效应”，而且在0．25Gy附近这种效应更为明显；低剂量D1（0．05，0．75Gy)的预照射降低了随后攻击量D2对细胞的损伤程度，反映出低剂量照射可诱发细胞存活的“适应性反应”。     

沉默乏氧诱导因子-1α和生存素基因联合X射线照射对乏氧细胞的体外抑瘤效应

为探讨RNA干扰（RNA interference,RNAi）沉默乏氧诱导因子-1α（Hypoxia induced factor -1α,HIF-1α）和生存素（Survivin）基因联合X射线照射对乏氧人肝癌细胞SMMC-7721的体外抑瘤效应,利用双靶向HIF-1α和Survivin基因载体,采用阳离子脂质体介导法转染SMMC-7721细胞,经乏氧培养36h后,分别以RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α和Survivin基因的mRNA及其蛋白表达,分别以四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞术检测细胞存活分数及细胞凋亡。结果表明,转染质粒pGenesil-Survivin-HIF的SMMC-7721细胞中,HIF-1α和Survivin基因mRNA表达水平与对照和阴性干扰组相比明显降低（p〈0．05）,也未检测到HIF-1α和Survivin蛋白的表达。单、双干扰联合放疗组存活分数较照射组明显降低（p〈0．01）,双干扰联合放疗组存活分数较其它组也明显降低（p〈0．01）。单、双干扰联合放疗组凋亡细胞百分数较对照组明显升高（p〈0．01）,双干扰联合放疗组凋亡细胞百分数较其它组也明显升高（p〈0．01）。结果提示,质粒pGenesil—Survivin—HIF可有效地干扰乏氧SMMC-7721细胞HIF-1α和Survivin基因的mRNA及其蛋白表达。双干扰联合放疗组对乏氧SMMC-7721细胞的体外抑瘤效应明显优于单干扰联合放疗组。     

碳离子辐射对人肝癌细胞SMMC-7721细胞周期和P53、MDM2及P21表达的影响

研究^12C^6＋离子辐照对体外培养人肝癌细胞SMMC-7721细胞周期和P53、MDM2及P21表达的影响。采用0、1．0、2．0、4．0、6．0Gy^12C^6＋离子束辐照细胞,用克隆形成法观察细胞存活情况;同时在辐照24h后用流式细胞仪检测细胞周期的变化,Western-blot检测细胞中P53、MDM2及P21蛋白表达情况。结果发现,重离子辐照后细胞存活率显著下降;1．0Gy、4．0Gy和6．0Gy照射组发生G0／G1期阻滞,而2．0Gy照射组出现G2／M期阻滞;Western-blot结果显示细胞辐照后MDM2的57kD蛋白表达水平无明显变化,而76kD蛋白表达水平随辐照剂量逐渐上升;P53和P21蛋白表达水平随辐照剂量增高。以上结果提示不同剂量的^12C^6＋离子束照射可激活SMMC-7721细胞不同的细胞周期检测点,其中G0／G1期阻滞与P53和P21蛋白以及MDM2截短体76kD蛋白的表达水平升高有关。     

质子辐射对人恶性黑色素瘤A375细胞的DNA损伤影响研究

为研究质子辐射对人恶性黑色素瘤的杀伤效应，本研究利用北京HI-13串列加速器提供的15 MeV质子，以0、1、2、4、8 Gy剂量辐照A375细胞，以细胞克隆术和流式细胞术检测A375细胞的克隆形成率、周期阻滞及凋亡率，用免疫荧光法检测2 Gy辐照后细胞的γH2AX焦点数，并与相同条件下的γ射线辐射对比。结果表明，在1～8 Gy剂量下，随着剂量的增加，A375细胞的存活率下降，在4～8 Gy剂量下，细胞的存活率明显低于γ射线。辐照后12 h,细胞G2/M期阻滞随剂量的增加而增加，质子辐射诱导的周期阻滞强于γ射线；辐照后48 h, γ射线诱导的细胞周期阻滞已基本解除，但质子诱导的细胞周期阻滞除1 Gy外，2～8 Gy均未完全解除。辐射诱导的细胞凋亡随照射剂量的增加而增加，随着时间的延长，凋亡比例有所增加，且质子诱导的细胞凋亡率高于γ射线。辐照2 Gy后，γ射线和质子诱导的γH2AX焦点峰值均在照后1 h出现，质子辐射诱导的γH2AX焦点数和大小均高于γ射线。以上结果表明，质子辐射可有效杀伤恶性黑色素瘤A375细胞，在黑色素瘤治疗中有潜在应用价值。     

G2期早熟染色体凝集技术预测肝癌细胞低LET射线辐射敏感性

用^60Co产生的γ射线照射人肝癌细胞系SMMC-7721.以克隆形成法测定经照射后的细胞存活率,用化学诱导剂Calyculin-A诱导的早熟染色体凝集（Premature chromosome condensation,PCC）技术研究染色体损伤.结果显示G2期细胞内的染色单体和等点染色单体断裂数与照射剂量之间存在着线性相关性,染色单体断裂数与细胞存活率之间存在较好的线性相关性.表明辐射诱导的染色单体断裂可以作为预测SMMC-7721细胞内在辐射敏感性的指标,也可为临床诊断和治疗肝癌提供依据.     

12C6+重离子辐照对人肝细胞、肝癌细胞端粒酶活性表达的影响

为探索碳离子束辐照对细胞中端粒酶活性的变化,利用兰州近代物理研究所重离子研究装置(Heavy ionresearch facility in lanzhou,HIRFL)产生的碳离子(31MeV/μ12C6 ),以人肝细胞HL-7702,肝癌细胞SMMC-7721为实验对象,用不同剂量1Gy、2Gy、3Gy、4Gy的重离子分别对两种细胞进行照射,用多聚酶链式反应.银染端粒重复序列扩增法(PCR-telomeric repeat amplification protocol,TRAP-PCR)银染端粒重复序列扩增法检测不同剂量下细胞端粒酶活性的变化.结果显示,人肝细胞HL-7702自身没有端粒酶活性,经1Gy辐照后也没有端粒酶活性,在2和3Gy处出现端粒酶活性,4Gy处端粒酶活性又消失.肝癌细胞SMMC-7721在1～3Gy处随着剂量的增大端粒酶活性升高,在4Gy处又开始下降;在1～3Gy处随着时间的推移端粒酶活性随着时间而加强(p<0.05).分析得知,重离子辐射可以诱导人肝细胞产生端粒酶活性,也可以改变肝癌细胞的端粒酶活性.端粒酶参与细胞受辐照后DNA单链损伤的修复;辐照后DNA双链断裂导致端粒酶活性减弱.本实验使重离子在辐照治疗中的优势得以体现.     

α辐射致细胞转化与基因突变

为探讨α辐射诱发体外细胞转化效应与hprt基因突变之间的相关关系。用体外培养的人胚肺细胞,经0．25－5Gyα粒子照射后,各受照射剂量组细胞兰固体琼脂培养集落形成能力明显增加,细胞获得了非锚着依赖性生长能力,说明人胚肺细胞在α辐射作用下发生了转化hprt基因突变检测。结果表明,随着α粒子照射剂量的增加,hprt基因变异系数逐渐增加。细胞转化与hprt基因突变相关分析证实,两者之间存在显著的线性正相关关系。研究结果显示,α辐射的致癌效应与hprt基因突变密切相关。     

γ线照后PHA、ConA和PWM激活的人血淋巴细胞转化、DNA单链断裂及其修复比较

本文采用~3H-TdR参入法和羟基磷灰石层析法,比较了~(60)Coγ射线照射后PHA、ConA、PWM激活的人血淋巴细胞的转化、DNA单链断裂及其修复,结果表明:受照后淋巴细胞转化受抑,在0—8Gy剂量范围内,剂量效应呈双相线性关系,其中PWM激活的细胞对射线的敏感性最低。三种细胞受照后DNA发生单链断裂,在0—30Gy范围内,与剂量呈线性相关,三者之间无显著差异。受15Gy照射后,细胞在37℃条件下能重接DNA断链,但重接不完全,重接后如经较长时间保温仍会发生再断裂,PWM激活的细胞重接修复率最高。淋巴细胞转化对辐射的敏感性可能与DNA断链的重接修复能力有关。     

188Re对血管平滑肌与内皮细胞的辐射差异性

为比较β射线对平滑肌和内皮细胞的增殖抑制作用，探寻血管内放射治疗中保护内皮细胞的措施，应用放射性核素^188Reβ射线对培养的平滑肌细胞和内皮细胞进行了辐射，通过细胞增殖计数，细胞增殖周期分析和^3H-TdR掺入实验观察，研究辐射对平滑肌和内皮细胞在增殖方面的影响，结果显示，5．2Gy剂量β辐射，平滑肌细胞增殖计数，细胞增殖率，^3H-TdR参入率显著下降，而内皮细胞的上述指标则无明显改变；高于10Gy，小于20Gy折剂量辐射，两组细胞的增匀受到明显抑制，表明在体外细胞培养条件下，平滑肌细胞及内皮细胞对高剂量β辐射的敏感性一致，而对低剂量β辐射，内皮细胞较平滑肌细胞耐受，5．2Gy低剂量β辐射，是一个既能有效抑制平滑肌细胞增殖，又不影响内皮细胞增殖，且对心肌细胞无损伤作用的血管内放疗窗口。     

miR-210反义慢病毒对乏氧人肝癌细胞放射敏感性的影响

为探讨miR-210表达下调对乏氧人肝癌SMMC-7721细胞放射敏感性的影响,利用分子生物学技术构建miR-210反义和随机寡核苷酸慢病毒载体,经慢病毒转染建立稳定转染miR-210反义和随机寡核苷酸的人肝癌SMMC-7721细胞株。以实时定量RT-PCR检测乏氧SMMC-7721细胞HIF-1αmRNA表达和miR-210表达,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,克隆存活实验检测细胞放射敏感性变化。结果表明:SMMC-7721细胞乏氧培养后,HIF-1α和miR-210表达随时间逐渐增加,稳定转染miR-210反义寡核苷酸能明显下调miR-210在乏氧细胞的表达;下调miR-210表达明显抑制乏氧SMMC-7721细胞体外增殖活性(P<0.05;P<0.01),诱导G1期阻滞(P<0.05),促进细胞凋亡(P<0.01),提高乏氧SMMC-7721细胞放射敏感性,放射增敏比约为1.21。结果提示,下调miR-210表达可抑制乏氧SMMC-7721细胞体外增殖,诱导凋亡,增强其放射敏感性。     

槲皮素对HeLa细胞辐射敏感性影响及其机理

为探讨药物槲皮素对HeLa宫颈癌细胞的辐射敏感性影响及其机理,使用不同浓度的槲皮素和不同照射剂量处理HeLa细胞,采用克隆形成法测定细胞存活率,应用流式细胞术测定细胞DNA双链断裂,以及测定槲皮素与电离辐射联合作用对HeLa细胞的周期影响.结果显示,不同槲皮素浓度处理组的HeLa细胞在不同照射剂量组间的存活率比较有统计...     

青蒿琥酯对人宫颈癌HeLa和Siha细胞辐照后DNA损伤水平的影响

为研究青蒿琥酯联合照射对人宫颈癌HeLa和Siha细胞DNA损伤的影响,取对数生长期细胞,通过MTT比色法测定不同浓度青蒿琥酯作用24h对HeLa和Siha细胞生长的抑制效应,将细胞分为单纯照射组和联合治疗组,每组分别给予0、2、4、6Gy四个剂量的60↑Coγ射线照射,应用单细胞凝胶电泳（SCGE）法检测青蒿琥酯对HeLa和Siha细胞照射后DNA损伤的影响。MTT结果表明,青蒿琥酯对宫颈癌HeLa和Siha细胞的生长抑制呈剂量依赖性。单细胞凝胶电泳法检测发现：联合治疗组HeLa细胞经0、2、4和60↑Coγ射线辐照后彗星细胞的尾部DNA百分数及Olive尾矩明显大于单纯照射组,差别有统计学意义（P〈0．05）,而Siha细胞联合治疗组与单纯辐照组相比,无明显差异。实验结果表明,青蒿琥酯对p53突变型予宫颈癌HeLa细胞具有明显的放射增敏作用,而对p53野生型子宫颈癌Siha细胞没有明显的放射增敏作用。     

125I籽源持续低剂量率照射诱导人肺癌细胞的旁效应

观察125I籽源持续低剂量率照射诱导人肺癌细胞损伤的旁效应.选择对高剂量率外照射敏感性不同的A549人肺腺癌细胞和NCI-H446人小细胞肺癌细胞,采用125I籽源离体照射细胞模式,将直接受照细胞与未受照细胞共培养24h,应用CB微核法和γH2AX荧光免疫分析法,检测2Gy和4Gy125I籽源持续低剂量率照射诱导人肺癌细胞的微核形成和DNA双链断裂水平.结果表明,125I籽源照射能显著诱导A549和NCI-H446细胞的微核形成率和γH2AX位点形成率增加的旁效应,显示增强对肿瘤细胞的杀伤作用.旁效应强弱与累积照射剂量、肿瘤细胞的辐射敏感性相关:对高剂量率外照射敏感的NCI-H446细胞对低剂量率照射及其旁效应的敏感性高于A549细胞,但与直接辐射效应相比,125I籽源照射诱导A549细胞旁效应高于NCI-H446细胞,这两种细胞的辐射旁效应均随累积照射剂量增加而降低,提示介导旁效应的信号因子水平可能随细胞损伤程度的增加而下降.     

12C6+离子辐照诱发人类肝L02细胞hprt基因突变的研究

本文研究12C6 离子辐照人类肝细胞系L02细胞诱发hprt基因突变与剂量的效应关系,为正确评价重离子对人体正常组织细胞的辐射风险及危害提供基础数据和依据.分别用12C6 离子束(LET为30 keV/μm)和X射线(LET为0.2 keV/μm)对L02细胞进行0～6Gy照射后,用克隆形成法检测细胞的存活分数,另外在含有6-TG的培养基中克隆、筛选hprt突变细胞株,测定突变频率.结果表明:12C6 离子辐照后L02细胞的存活分数明显小于X射线照后.两种射线照射后,每106个存活细胞中突变克隆的个数随照射剂量增大而增大,受照细胞的突变频率也都在1Gy处最大.但相对于X射线,人类肝细胞系L02细胞对高LET重离子辐射更敏感,而且12C6 离子束诱发更多的存活细胞hprt基因突变.     

辐射基因治疗黑色素瘤的实验研究

研究低剂量辐射结合腺病毒(AdCMV)载体介导的p53基因转导对人黑色素瘤A375细胞系基因转移效率和辐射敏感性的影响.用复制缺陷的重组腺病毒载体(AdCMV-p53)介导入p53基因转染1 Gy X-射线预辐照的A375细胞系,RT-PCR检测mRNA水平,流式细胞仪测定细胞周期阻滞及外源性P53蛋白表达情况,克隆形成率测定辐射后细胞存活率.用携带报道基因的复制缺陷重组腺病毒载体AdCMV-GFP作为对照.实验结果表明,1 Gy X-射线辐照可较高地增加AdCMV-p53对A375细胞的基因转导效率,转导的外源性野生型p53可在A375(wtp53)细胞中高效表达,并诱导细胞周期G1期阻滞;单纯转导p53对A375细胞无明显诱导凋亡和生长抑制效应;而转导p53后给予X-射线辐射,当剂量达到4 Gy及其以上时,48h后AdCMV-p53感染组细胞开始出现明显形态改变,克隆存活率明显低于AdCMV-GFP感染组和未感染组,显示存活曲线下移,4Gy时细胞存活率就减少了1个量级.小剂量辐射既可有效增加AdCMV-p53介导的p53转导,又不会对患者产生明显副作用;转导野生型p53的人黑色素瘤A375细胞系显示P53过表达;过表达的P53蛋白虽然对A375细胞无明显生长抑制及凋亡诱导作用,但可明显增加其辐射敏感性.这表明p53是基因治疗黑色素瘤较好的侯选基因,也为临床上放疗联合基因治疗黑色素瘤提供了实验室依据,即减轻临床上对于辐射敏感性差的肿瘤单纯大剂量照射或单纯基因疗法中rAd-p53制品用量过大而给病人造成的毒副作用.     

X射线全身照射对成年小鼠睾丸Smad4表达的影响

探讨转化生长因子-β超家族细胞内信号转导分子Smad4在X射线全身照射后小鼠睾丸中表达变化及其意义。采用不同辐射剂量0．1 Gy、0．5 Gy、1．0 Gy、1．5 Gy和2．0 Gy对成年BALB／c小鼠进行全身照射,于照射后16h、1周、2周、3周、4周分别取小鼠睾丸组织制备标本,免疫组织化学ABC法检测Smad4的表达及变化,并通过图像分析技术对实验结果进行统汁学分析。正常小鼠睾丸Smad4的阳性表达主要集中在间质细胞,支持细胞有少量表达,生精细胞呈阴性反应。照射后各时间点Smad4在间质细胞的表达明显减少;而Sertoli细胞的表达随剂量增加和时间延长均无明显变化。照射后16h 2．0 Gy组,Smad4在生精小管的减数分裂前生精细胞内出现少许表达,从第2周起,1．0 Gy和1．5 Gy组生精细胞内也出现少量表达;第3周,各照射剂量组Smad4在减数分裂前精原细胞和精母细胞内呈强阳性反应,持续至第4周。统计学分析,随辐射剂量增大,观察时间延长,Smad4在减数分裂前生精细胞内的表达量逐渐增加。Smad4在小鼠睾丸不同剂量全身辐射后不同时间点表达及分布的变化,表明Smad4及其介导的TGF-β／Smad信号转导通路参与了小鼠皋丸辐射损伤及损伤修复过程。