烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）SRAP-PCR 体系建立及优化

采用烟草靶斑病菌YC-9, LJT-8和QYS-7为DNA模板,初步筛选SRAP引物组合;采用L16(45)正交试验设计,对烟草靶斑病菌的SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs, Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板浓度等5个因素进行优化试验。结果表明:共筛出13对扩增条带清晰且多态性好的引物组合;烟草靶斑病菌的最佳SRAP反应体系为Mg2+浓度2.0 mmol/L、dNTP浓度200μmol/L、Taq DNA聚合酶0.8U、引物浓度140 mmol/L、模板DNA 20 ng及1×PCR buffer,反应总体积为20 μL;各因素对SRAP-PCR扩增反应结果影响的差异较大,依次为Taq DNA聚合酶>引物> Mg2+> dNTPs=模板DNA。      

新型植物油莎豆DNA提取与SRAP体系优化

以14个不同地理来源的油莎豆品系为实验材料,研究了油莎豆DNA快速提取方法;以SRAP反应体系中DNA模板量、Mg2＋浓度和引物浓度3个因子分别设置3个水平,共配制27个反应体系,对油莎豆SRAP反应体系进行优化。研究结果表明：改良CTAB法可获得较高质量的DNA,参试材料的A260/A280介于1.70～1.98;在27个SRAP反应体系（15μL）中,最优反应体系为DNA模板25ng、Mg2＋1.5mmol/L、引物浓度1μmol/L、dNTPs 0.3mmol/L和Taq酶1U,可扩增出清晰稳定的多态性条带。     

大豆SCoT分子标记技术体系的优化、验证及检测

采用L25（56）正交试验和单因素试验2种方法对影响大豆SCoT-PCR反应的Mg2＋浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度和模板DNA用量等因素进行优化,优化后的20μL大豆SCoT-PCR体系为：Mg2＋浓度2.0mmol·L-1、Taq聚合酶用量1.5U、引物浓度0.250μmol·L-1、dNTPs浓度0.2mmol·L-、DNA模板用量30ng;退火温度最适为50.4℃.运用18个大豆品种验证,该反应体系稳定、可靠,并从82条引物中筛选出条带清晰、多态性较好的32条引物.利用大豆品种吉育75、本地黑豆及其10株F2对该反应体系进行了初步的遗传验证,结果显示,杂交后代植株中出现了双亲的位点和亲本位点的缺失.该反应体系的建立为大豆种质遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建及分子标记辅助育种提供了新的技术手段.     

蓖麻DNA的提取及SRAP反应体系的建立

为建立蓖麻快速有效的DNA提取方法和SRAP标记的技术体系,本研究采用SDS法和CTAB法对蓖麻不同叶片（新鲜嫩叶、老叶和陈旧的嫩叶、老叶）的基因组DNA进行提取,并以DNA模板用量、Mg^2＋浓度、引物浓度和Taq酶用量4个因素的不同水平配制了10个反应体系对蓖麻SRAP反应体系进行优化。结果表明,SDS法和CTAB法均可获得较高质量的DNA,多数样品的A260／A280值介于1．7～1．9之间,但以CTAB法更为省工省时,不同叶片DNA的提取效果,以嫩叶效果最佳;设计的10个反应体系中,以反应体系A（总体积为15μL,40ng DNA模板,1．5mmol／L Mg^2＋浓度,0．2mmoL／L dNTPs,0．3μmol／L引物浓度和1Unit Taq酶）最为经济适用,将该体系用于蓖麻的SRAP扩增能获得稳定、清晰的多态性条带。本实验为蓖麻的遗传多样性研究及目标性状的分析定位提供了技术支撑。     

发酵肉制品总微生物RAPD扩增条件的优化

以改进的氯化苄法抽提发酵肉制品总微生物DNA,进行随机扩增多态DNA(random amplifiedpolymorphicDNA,RAPD)分析.采用单因子梯度试验法对影响发酵肉制品微生物RAPD反应的反应体系、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶的用量及DNA模板浓度进行了筛选.结果表明,发酵肉制品微生物RAPD扩增条件为25μLPCR反应体积中,2.5mmol/LMgCl2,0.15mmol/LdNTPs,15pmol引物,50ng模板DNA,1.0U Taq DNA聚合酶.     

烟草SSR反应体系的优化

以烤烟品种NC2326、G28及其F1为材料,研究了烟草SSR分析中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响。结果表明:在总体积为20μL的PCR反应中,含20ng模板DNA,1.5U TaqDNA聚合酶,MgCl2终浓度为1.5mmol.L-1,dNTPs浓度为200μmol.L-1,引物浓度为0.25μmol.L-1时效果较好。     

烤后烟叶SSR反应体系的优化研究

以烤烟RG11品种为原料,研究烤后烟叶简单重复序列(SSR)分析中聚合酶链式反应(PCR)体系各主要因素及其之间的相互作用对SSR扩增的影响,结果表明:烤后烟叶SSR-PCR反应最佳体系为20μL体系中含35 ng模板DNA,1.5 U TaqDNA聚合酶,2.375 mmol/L MgCl2,0.6 mmol/L dNTPs和0.4μmol/L引物.     

导入马齿苋DNA的烟草D4代株系的SRAP分析

采用花粉管通道法将马齿苋DNA导入烟草,并经4次连续自交获得第4代材料(D4),选择其中32个株系进行SRAP纯度分析。结果表明:通过条件优化建立了烟草SRAP-PCR反应体系,即每10μL溶液中含有0.2mmol/LdNTP、20ng模板DNA、30nmol/L引物、0.5UTaq聚合酶和2mmol/LMgCl2;最佳复性温度和循环次数分别为53℃和35次;选用118对引物组合构建了烟草D4代的指纹图谱,其中不同引物组合产生的DNA片段数目在10～30之间,大小分布于100～700bp,且共扩增出1052条扩增产物,其中10条带表现出多态性,多态性比率仅为0.95%,说明使用SRAP标记检测烟草后代纯度是可行的。     

快速鉴定啤酒污染菌的RAPD反应条件优化

随机扩增多态性DNA（RAPD-PCR）技术是一种快速、简单的鉴定技术，在啤酒污染菌的快速鉴定和研究腐败菌的多样性方面具有重要的应用价值。本次研究表明采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法能够有效地提取成分复杂的MRS培养基中的细菌DNA。对基于引物M-13的RAPD．PCR的反应体系进行优化，确定最佳的反应体系为：Mg^＋的浓度为3．5～4．0mmol／L，引物浓度为2．0μmlol／L，模板浓度为4．8～0．48ng／μL，每种核苷酸的浓度为200／maol／L，Taq DNA聚合酶添加量为2．5U／25μL，退火温度为42℃。对32株分离的啤酒污染菌株进行RAPD—PCR扩增鉴定，结果表明RAPD的指纹清晰，重复性好，适用于构建标准菌的指纹数据库。     

茶树叶绿体DNA的PCR-RFLP反应体系优化

通过正交设计对影响茶树聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)反应体系的主要因素进行优化,快速确立适合茶树叶绿体DNA PCR-RFLP分析的扩增体系和酶切体系。结果表明：最佳PCR扩增体系为100ng模板DNA、200μmol/L dNTPs、1.5mmol/L MgCl2、50ng叶绿体引物、3U TaqDNA聚合酶、加ddH2O至25μL;最佳酶切体系为6μL扩增产物用量、2U限制性内切酶量、1×限制性内切酶buffer、加ddH2O至15μL,37℃酶切6h。利用优化的反应体系,对30个茶树品种叶绿体DNA进行PCR-RFLP扩增,可获得清晰扩增图谱和多态性酶切图谱。     

烟草DNA的提取与SRAP反应体系的建立

以10个烟草栽培品种为试验材料,研究了烟草DNA的提取方法以及对建立烟草SRAP-PCR反应体系的影响因子设置梯度实验,筛选和建立可扩增多态性高、重复性好、带型清晰的最佳SRAP-PCR反应条件:在25μL的反应体系中,MgCl22.0mmol、dNTP200μmol,上下引物各30ng、DNA模板40ng、DNA聚合酶1.5U,扩增程序为:在94℃预变性5min,反应前5个循环在94℃1min,33℃1min,72℃1min条件下运行;随后的30个循环复性温度提高到53℃,最后72℃延伸5min。本文还讨论了不同分子标记在烟草中应用的优缺点以及SRAP分子标记在烟草上的应用前景,提出了应用SRAP分子标记构建烟草遗传图谱的可行性。      

桑黄DNA提取及RAPD反应体系的优化

以桑黄菌丝体为实验材料,采用CTAB法与SDS法提取DNA,并对RAPD反应体系进行优化。结果表明,应用CTAB法提取的DNA纯度和完整性较好,在此方法上建立了桑黄RAPD反应最佳体系(25μL):模板DNA1.0μL,引物0.8μL,dNTPs0.6μL,Taq聚合酶0.3μL,Buffer2.5μL,ddH2O19.8μL,并通过正交实验验证了该反应体系的稳定性和通用性。PCR扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,40℃退火1min,72℃延伸1.5min,45个循环,72℃最终延伸5min。     

PCR 方法检测河豚鱼的引物筛选及反应体系优化

根据Genbank 公布的河豚鱼细胞色素b 基因序列,应用软件Primer Premier 5.00 版设计了7 对引物,经过PCR 筛选,确定可以在所有8 个供试河豚鱼样品中检出目的DNA 片段的引物HT-1,用于建立河豚鱼的PCR 检测方法。对该PCR 方法中6 个因素包括退火温度、Mg2+ 终浓度、Taq DNA 聚合酶用量、dNTPs 终浓度、引物终浓度和模板DNA 用量进行优化,确定优化的PCR 扩增体系：10 × PCR 缓冲液2μL,MgCl2 终浓度1.5mmol/L,Taq DNA 聚合酶1.0U,dNTPs 终浓度300μmol/L,引物终浓度0.2μmol/L,DNA 模板400ng,加纯水至总体积20μL。扩增程序定为94℃预变性5min,94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸30s,40 个循环,72℃延伸5min。据此建立河豚鱼成分PCR 检测方法,并通过河豚鱼与非河豚鱼的PCR 检测结果比较,验证了该方法的河豚鱼特异性。研究结果还表明,该方法的检出限为0.1%,含量为0.1% 的河豚鱼样品PCR 检出率至少在97.5% 以上。