鲤鱼组织蛋白酶L的分离纯化与酶学性质研究

对鲤鱼鱼背部白肌中的组织蛋白酶L进行分离纯化并研究了其酶学性质。结果发现,鲤鱼组织蛋白酶L提取液经酸处理、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose F.F.离子交换层析和SephacrylS-100凝胶过滤层析等步骤后得到部分纯化,纯化倍数为16.39。鲤鱼组织蛋白酶L的最适反应温度和pH值分别为40℃和5.0,在20～50℃和pH 4.5～5.5范围内具有较好的稳定性。     

南极磷虾蛋白酶分离纯化及部分性质研究

对在南极磷虾自溶过程中起主要作用的蛋白酶的分离纯化条件和主要生化性质进行了研究。经过30%～70%硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,Sephacryl S-200 HR凝胶层析后得到电泳纯的蛋白酶,该酶纯化倍数为12.59,产率为43%,分子质量约为28 ku;最适pH和最适温度为pH 8.0和50℃;该酶pH稳定范围为pH 7.0～9.5,并在45℃以下较稳定;苯甲基磺酰氟(PMSF)、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、对甲苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮(TLCK)对该酶活性有较强的抑制作用。     

牛胰脏组织蛋白酶L的纯化和酶学性质

新鲜牛胰脏匀浆物经酸化粗提后,再通过盐析、柱层析等步骤纯化,制备了0.58 mg纯酶,纯化倍数达530.54。经凝胶电泳分析,该酶有2 个亚基,分子质量为29.1 kD和18.9 kD。牛胰脏组织蛋白酶L的最适反应温度为50 ℃,最适反应pH值为6.5。巯基还原剂二硫苏糖醇、L-半胱氨酸均明显激活了该酶活性,10 μmol/L的N-（反式-环氧丁二酰基）-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺（E-64）可完全抑制其活性。1 mmol/L的Zn2＋对酶活性有明显抑制作用。该纯化酶可水解苄氧羰基-苯丙氨酰-精氨酰-甲基香豆素（Z-Phe-Arg-MCA）,其Km值为3.52 μmol/L。     

生姜蛋白酶的分离、纯化及酶学性质研究

从生姜中分离得到具有凝乳活力的生姜蛋白酶,研究了其酶学性质和动力学特性。主要研究结果如下:采用超滤技术分离得到生姜蛋白酶粗酶液,在0⁰.3 mol/L NaCl线性梯度下利用弱阴离子交换树脂将生姜蛋白酶分成具有相同分子质量的A和B两个组分。生姜蛋白酶A和B具有相似的酶学性质和水解k-酪蛋白的亲和性,表明生姜蛋白酶A和B可能是同工酶,可以合并在工业生产中使用。该研究为生姜蛋白酶的工业化应用及姜汁奶的开发提供了重要的理论基础。     

罗汉果蛋白酶的分离纯化和部分性质研究

对罗汉果蛋白酶的分离纯化和部分性质进行研究.利用硫酸铵盐析、离子交换和凝胶过滤柱层析对罗汉果蛋白酶进行了分离纯化,对纯化所得的酶进行了分子量和等电点测定.结果表明,纯化酶为电泳纯,回收率为4.2％,纯化倍数为31.1,凝胶过滤层析和SDS-PAGE电泳测得酶的分子量分别为40.3 ku和39.0 ku,等电聚焦电泳测得其等电点为8.55.     

鲢鱼背肌组织蛋白酶L的初步分离及蛋白层析纯化方法

研究鲢鱼背肌中组织蛋白酶L的初步分离和纯化方法,重点研究初步分离过程中酸化处理条件、硫酸铵饱和度和透析袋分子质量对粗酶液中组织蛋白酶L活性的影响,以及纯化过程中不同类型离子交换层析柱和离子交换平衡缓冲液pH值对蛋白层析纯化的影响。结果表明:盐析最佳硫酸铵饱和度范围55%~90%,酸处理最优条件pH 3.0,40 ℃热处理10 min后pH值回调至6.0,透析袋最佳分子质量7 000 u。采用弱阴离子交换和分子筛两步层析法,选取20 mmol/L、pH 6.0磷酸盐缓冲液作为弱阴离子柱的平衡缓冲液,可得到45 ku电泳纯组织蛋白酶L,其纯化倍数为487,回收率为22 mg/1 000 g。本法可最大限度地去除杂蛋白且操作简便、回收率高,为探究鱼糜凝胶劣化现象的有效抑制方法奠定了良好的基础。     

生姜蛋白酶的分离纯化

生姜蛋白酶能够特异地水解P2位置是脯氨酸(Pro)的肽和蛋白质,这种对Pro的特异性使生姜蛋白酶成为一种非常有前途的用于蛋白质测序和蛋白质中稳定结构域识别的工具酶。中国传统食品“姜撞奶”采用姜汁作为凝乳剂,其中的凝乳因子已被证明是生姜蛋白酶。生姜蛋白酶的凝乳性质使之有望成为奶酪生产中小牛皱胃酶的替代品。此外,生姜蛋白酶在工业上还有更广阔的应用前景。本研究针对生姜蛋白酶的特点,制订一套简便有效的纯化方案,为进一步的基础研究和应用研究提供合格的样品酶。经过实验确立了以下纯化方案:将生姜制成丙酮粉,然后用20倍(W/V)0.1mol/L,pH8.0的磷酸缓冲液提取;上清液加硫酸铵至40%饱和度,其间控制pH>7.0,离心弃去沉淀,上清液继续加硫酸铵至80%饱和度,离心,取沉淀;将沉淀先对0.1mol/L的氨水透析2h,然后对蒸馏水透析至无SO42-检出,最后对层析初始缓冲液进行延长透析至内外离子强度相等;上DEAE-纤维素DE-52柱;层析初始缓冲液为0.01mol/L,pH8.0Tris(含0.5mmol/LDTT,0.2mol/LNaCl),0.05～1mol/LNaCl梯度洗脱,柱1.55.0cm,流速0.75cm3/min,收集速度3ml/管,收集酶活峰,得到在SDS-PAGE上表现为一条带的样品C1和C2。     

凡纳滨对虾肌肉中组织蛋白酶L提取工艺优化及分离纯化

优化凡纳滨对虾肌肉中组织蛋白酶L提取工艺,分离纯化组织蛋白酶L并验证其对肌原纤维蛋白的降解作用.以凡纳滨对虾肌肉为原料,采用单因素试验、Plackett-Burman试验和双因素等重复试验对肌肉中组织蛋白酶L的提取工艺进行了优化.采用Tris-HCl缓冲液浸提、硫酸铵沉淀、Q-Seharose F.F阴离子交换层析、S...     

巴西松子中蛋白酶的分离纯化及酶学性质

在单因素试验基础上,通过正交试验研究pH值、提取时间和料液比3个因素对巴西松子中蛋白酶活力的影响,得出巴西松子中蛋白酶的最佳提取缓冲液为pH9.0的硼酸-硼砂缓冲液、提取时间为60min、料液比为1:8(m/V);采用(NH4)2SO4沉淀、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析分离纯化巴西松子中的一种蛋白酶,结果表明:纯化后蛋白酶比活力提高到了8.61倍,回收率为21.65%。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明:该蛋白酶分子质量为33kD。酶学性质结果表明:该蛋白酶最适pH值为9.0,属碱性蛋白酶;反应的最适温度为50℃;金属离子Mn2+对该蛋白酶活性有强烈的激活作用,而Ca2+、Mg2+和Cu2+对酶活性有抑制作用。     

章鱼消化道蛋白酶的分离纯化及性质

以章鱼加工下脚料消化道为原料,经硫酸铵沉淀、纤维素CM-52阳离子交换层析、DEAE-Sephadex A50阴离子交换层析、SDS-PAGE电泳等方法,从中提取纯化出一种蛋白酶电泳纯样品OP-I,并对其性质进行研究。结果表明：该酶分子质量为80.5kD。最适反应温度为55～60℃,pH值为7～9。金属蛋白酶抑制剂(EDTA)可以完全抑制该酶的活性。Mn2+、Ca2+、Mg2+对OP-I有激活作用,酶促动力学研究显示其米氏常数Km为0.33mmol/L,Vmax为66.7mg/(mL ·min)。     

蓝圆鲹肌肉组织蛋白酶B的纯化与性质分析

在鱼糜制品生产过程中,凝胶劣化现象是引起鱼糜品质下降的重要原因。研究表明,溶酶体中的内源性组织蛋白酶B会促进肌原纤维蛋白的降解,进而导致鱼糜凝胶劣化。迄今为止,多种鱼体肌肉中的组织蛋白酶B已有研究,但海水经济低值鱼蓝圆鲹中该酶的情况却尚未报道。本研究采用硫酸铵沉淀和柱层析相结合的方法,从蓝圆鲹肌肉中分离纯化得到分子量约为27ku的组织蛋白酶B。酶学性质结果显示,该酶最适温度和最适pH分别为55℃和5.5,半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64能有效抑制其活性。对肌原纤维蛋白的降解实验表明,在最适条件下,蓝圆鲹组织蛋白酶B对肌原纤维蛋白有一定的降解作用。因此,组织蛋白酶B参与肌原纤维蛋白的降解,更可能参与在低pH条件下鱼糜凝胶劣化。      

A rapid purification procedure for cathepsin L from bovine species and production of specific antibodies

Two approaches have been carried out for the production of polyclonal antibodies specific of bovine cathepsin L (EC 3.4.22.15). The first one consisted in the purification of cathepsin L from bovine liver, through the development of an original protocol that can be achieved in 4 days, and further injection in rabbits. The purification scheme included the preparation of an enriched lysosomal extract, selective precipitation with ammonium sulfate and different chromatographic steps including size‐exclusion chromatography, cation‐ and anion‐exchange chromatography and the use of an affinity column for the removal of trace amounts of bovine serum albumin. The final enzyme preparation was purified 8400‐fold and consisted predominantly in the double‐chain form of cathepsin L. This was proved by the presence of a main protein band with M_r of 25 kDa, corresponding to the cathepsin L heavy chain, in SDS‐PAGE under reducing and denaturant conditions, and was further confirmed by immunoblotting. The second approach consisted in the generation of polyclonal antibodies against the peptide sequence ⁹⁹PECSAANDTGFVDIPQR¹¹⁵, specific of the bovine cathepsin L heavy chain. Both types of antibodies were proved to specifically recognize cathepsin L. However, while antibodies raised against the whole protein recognized native cathepsin L, the antipeptide was able to recognize the enzyme in its denatured form. Both of them are adequate for the future development of immunoassays, allowing a rapid and accurate quantification of cathepsin L levels directly in crude extracts of meat and meat‐derived products. Copyright © 2004 Society of Chemical Industry     

海参肠组织蛋白酶D的提取及酶学特性研究

本研究以海参肠为原料,采用p H3.0 50 mmol/L甘氨酸-盐酸缓冲体系,按1∶6（w/v）的料液比,在4℃浸提1 h,获得海参肠组织蛋白酶D的粗酶液。以酸变性牛血红蛋白为底物,进行酶活测定,并研究了该酶的酶学性质。结果表明,海参肠组织蛋白酶D粗酶的最适p H为3.0,在p H3.0⁷.0之间稳定性较好;最适反应温度为50℃,在4⁴0℃具有较高稳定性。5 mmol/L的金属离子Mg²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺和K⁺对该酶有激活作用,而Fe³⁺和Fe²⁺则对其有抑制作用。天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin A对该酶活性有较强的抑制作用。上述结果说明,在本研究条件下提取获得的海参肠组织蛋白酶D粗酶是一种酸性蛋白酶,其组成以天冬氨酸蛋白酶为主。      

九孔鲍鱼纤维素酶的分离纯化与性质分析

采用SP-Sepharose阳离子葡聚糖凝胶交换柱层析、Sephacryl S-200丙烯葡聚糖凝胶柱层析和Hydrox-yapatite羟基磷灰石柱层析,从九孔鲍鱼(Haliotis diversicolor)消化腺中分离纯化到一种纤维素酶。SDS-PAGE结果显示,该酶的分子质量约为55kDa。该酶水解羧甲基纤维素钠的最适温度50℃,最适pH5.5。该酶在温度40℃以下,pH5.0～7.0之间具有较好的稳定性。     

番石榴多酚氧化酶的部分纯化及其特性研究

番石榴PPO的粗提取液经过80%硫酸铵盐析和DEAE-Toyopearl 650M、CM-Sephadex C-50离子交换柱层析分离后,被纯化了约126倍,回收率为16.13%。该酶迅速地催化焦性没食子酸的酶促氧化反应,而对对苯二酚和绿原酸则完全无催化活性。该酶对焦性没食子酸的Km值为4.6 mmol/L,其最适pH为7.5,pH稳定性范围在pH4.0~11.0,最适温度为50℃,热稳定性相对较高,在≥90℃加热10 min后仍残留约15%的酶活性。该酶的最佳抑制剂是抗坏血酸和NaHSO3,其次是植酸、盐酸-L-半胱氨酸、柠檬酸,Ca2+、Mg2+等金属离子对该PPO也有较强的抑制作用。     

Purification and characterization of pectin methylesterase from acerola (Malpighia glabra L.)

The enzyme pectinmethylesterase (PME) from acerola was extracted and purified by gel anion‐exchange chromatography (Q Sepharose) and filtration on Sephadex G‐100. The results showed two different PME isoforms (PME1 and PME2), with molecular masses of 25.10 and 5.20 kDa, respectively. PME1 specific activity increased by 9.63% after 60 min incubation at 98 °C, while PME2 retained 66% of its specific activity under the same conditions. The K_m values of PME1, PME2 and concentrated PME were 0.94, 0.08 and 0.08 mg mL^?1, respectively. The V_max value of PME1, PME2 and concentrated were 204.08, 2, 158.73 and 2.92 µmol min^?1 mg^?1 protein, respectively. Copyright © 2007 Society of Chemical Industry     

大麦虫超氧化物歧化酶分离纯化及性质研究

目的：探讨大麦虫超氧化物歧化酶(SOD)分离纯化条件及其性质,为大麦虫利用提供科学依据。方法：以大麦虫为原料,经盐析沉淀、DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等纯化, 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法对蛋白质的组分进行分离并确定其分子质量,原子吸收光谱仪鉴定酶的类型。结果：获得了一种酶比活力较高的大麦虫SOD,酶的纯化倍数为68.54倍,分子质量为37.30kD,属于含铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD),且在278nm波长处有紫外吸收峰,稳定性较好,最适温度为40℃,最适pH值为6.0,对H2O2、β-巯基乙醇试剂十分敏感,受氯仿-乙醇混合液(3:5,V/V)的影响较小。结论：大麦虫SOD具有较高的酶比活力,稳定性好,具有较高的利用价值。