层析法分离纯化纳豆激酶的技术参数研究

采用柱层析技术对盐析后的纳豆激酶发酵液进行分离纯化,以确定层析分离纳豆激酶的技术参数.对比了Sephadex G-50及Sephadex G-7凝胶层析分离纳豆激酶的效果,并进行了不同pH值条件下的层析效果分析.结果表明,在pH值为6.4时,经Sephadex G-75凝胶层析及SP Sepharose FF离子交换层析后,能够得到较高纯度的纳豆激酶,使纳豆激酶纯化了9.2倍,回收率为51.5％.SDS-PAGE电泳显示所得纳豆激酶为单一蛋白带,其分子质量为28ku.     

层析法分离纳豆激酶的研究

选高产酶的纳豆杆菌发酵,发酵液离心除菌后加入饱和度为30%硫酸铵去杂,然后加入65%的硫酸铵析出纳豆激酶粗提物,然后将粗提物分别过阴阳离子交换柱和疏水层析柱进行提纯酶。比较其提纯倍数和回收率,得出较好得分离纯化方案为:样品依次经过DEAE-SepharoseFastFlow阴离子层析、CM-SepharoseFastFlow阳离子层析和Penpyl-SepharoseCl-4B疏水层析柱,纳豆激酶最终纯化倍数达到32.2,回收率为13.2%。     

纳豆激酶分离纯化研究进展

纳豆激酶是枯草芽孢杆菌发酵过程中产生的一种碱性蛋白酶,具有较强的溶栓作用。与其他溶栓剂相比,纳豆激酶易被吸收,作用迅速,安全性好,可做为新型溶栓剂。文中概述了纳豆激酶的理化性质和作用机制,着重介绍了纳豆激酶的几种常见的分离纯化方法,包括柱层析法、超滤法、萃取法和亲和颗粒法,以及集成化分离纯化技术,并对纳豆激酶分离纯化的新方法进行了展望,以促进纳豆激酶的深入开发和应用。     

纳豆激酶的分离纯化及其特性研究

从实验室保存的1株高产纳豆激酶菌株出发,进行发酵产酶,确立具有纤溶活力的纳豆激酶的分离纯化工艺,主要通过硫酸铵分级盐析法和Phenyl Sepharose疏水柱层析进行分离纯化,用纤维蛋白平板法测定酶活力,用SDS-PAGE电泳验证为电泳纯,分子质量为28 ku。试验了不同作用温度、pH值和金属离子对NK活力的影响。结果表明,NK的适宜温度为25~50℃,适宜pH值为7.0,Cu2+,Mn2+,Hg2+是其抑制剂,而Mg2+,Ca2+为激活剂。     

毕赤酵母表达重组纳豆激酶的分离纯化

采用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100柱层析以及冷冻干燥等步骤,对毕赤酵母基因工程菌发酵液中的纳豆激酶进行分离纯化,得到电泳纯的有溶栓活性的纳豆激酶.冷冻干燥品在SDS-PAGE胶上呈一条蛋白质带,其酶的比活力提高到610.64U/mg,纯度为粗酶液的15.92倍.     

纳豆激酶分离纯化方法的研究

采用硫酸铵二级盐析、330(OH)型树脂脱色、CM-52阳离子树脂离子交换层析三步法从发酵液中提取纳豆激酶。结果发现:(1)硫酸铵盐析采用20%~60%饱和度范围,纯化倍数为3.23,收率为72.36%;(2)330(OH)型树脂脱色,在脱色的同时可以除去杂蛋白,样品纯度达到电泳显示2条带;(3)CM-52阳离子交换树脂对纳豆激酶属于优吸型吸附,在pH6.0,0.01mol/L的PBS中交换效果最好,可以得到电泳纯的纳豆激酶,总收率为48.51%。     

纳豆激酶分离纯化的工艺研究

通过对纳豆激酶分离纯化工艺的研究,得出:纳豆激酶发酵液经离心、过滤及CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析纯化后,纯化液经SDS-PAGE电泳为一条单一色带,纯化倍数达29.6.经中试扩大试验,效果基本一致.通过初步的冻干试验,得出最佳赋型剂为1%甘露醇和2%甘氨酸.     

纳豆激酶分离纯化及纤溶活性研究

经过生理盐水浸提、(NH4)2SO4分级沉淀、Sephadex G-100凝胶层析等纯化步骤,从纳豆中获得层析纯的纳豆激酶,纯化倍数15.6,回收率10.2%,SDS-PAGE电泳显示为二个组分,分子量在29000左右。对其纤溶性质研究表明:纳豆激酶活性的最适pH为8.0,pH6～10溶液中40℃以下基本稳定,pH<5失去纤溶活性;模拟胃环境的酸性条件下,粗酶失去纤溶活性,而纳豆生理盐水浸提液纤溶活性保持25%;SDS-PAGE电泳显示,胰蛋白酶对纳豆激酶成分没有降解作用;体外溶栓作用表明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。     

枯草芽孢杆菌纳豆激酶分离纯化及酶学性质

利用30%～70%饱和度的硫酸铵沉淀,Sephadex G-50凝胶过滤层析对浅盘发酵纳豆激酶进行分离纯化并对其酶学性质进行初步研究。以纤维平板法测定纳豆激酶活力,SDS-PAGE检验纯化效果。结果表明:纯化后纳豆激酶为电泳纯,分子质量约27.518kD,纯化倍数和酶活回收率分别为19和42.1%,纳豆激酶最适温度为50℃,最适宜pH值为8.0。     

纳豆激酶高产菌株的筛选及纳豆激酶的初步分离研究

从日本传统食品纳豆中筛选获得一株高产纳豆激酶的盐芽孢杆菌菌株,其产酶能力为227IU/g。该菌株经过固体发酵后获得含酶发酵物,采用硫酸铵分步盐析的方法对纳豆激酶进行了分离纯化,其沉淀物即纳豆激酶,经过分步盐析纳豆激酶的纯化倍数为1.34。     

纳豆激酶的纯化及性质研究

从固态发酵培养的纳豆中提取纳豆激酶 ,采用盐析、疏水层析、离子交换层析等方法 ,对提取液进行纳豆激酶的分离纯化。经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 ,活性酶蛋白为单一组分 ,并测得其分子质量为 2 8ku。纳豆激酶在pH5 0～ 1 0 0 ,4～ 3 7℃范围内具有较好的稳定性 ,其纤溶活性可被 0 1mmol/L的PMSF完全抑制。体外溶栓实验表明 ,纳豆激酶为纤溶酶而不是纤溶酶原激活剂。     

纳豆激酶活性的检测及纳豆粉筛选

对纳豆激酶活性的检测方法进行了总结,结合生产及操作人员的实际情况总结出适合企业操作及评估的检测方法,并利用该方法对6种纳豆粉原料进行筛选,选择溶栓功能稳定、纳豆粉溶解性良好并经过脱臭处理的原料用于产品的生产。     

一步亲和纯化蒜氨酸酶及其酶学性质研究

以自制S-烷基-L-半胱氨酸为配基的亲和凝胶直接从独头蒜粉碎液中提取蒜氨酸酶.用自制亲和凝胶吸附蒜氨酸酶后,考察含0.2 mol·L-1葡萄糖溶液的洗脱效果.利用SDS-PAGE对酶纯度进行检验,并研究温度、pH和底物浓度对酶活性的影响.结果表明,利用葡萄糖溶液洗脱,得到8.29倍的纯酶.而阴性对照纯化倍数为3.78倍.提纯的蒜氨酸酶为电泳纯,亚基约为50 kDa和44 kDa.以合成的蒜氨酸为底物,蒜氨酸酶的最适温度是40℃,最适pH4.92,Kin为19.795μmol·mL-1,Vmax=8.446 μmol·mg-1·min-1.     

来自基因工程菌E.coli BL21/pET-DsbA-MalQ的麦芽糖转糖基酶的分离纯化及酶学性质研究

通过6-His的分离标签,联合采取硫酸铵沉淀,生物半透膜透析和亲和层析等方法,纯化了目标酶。通过使用凝血酶切割DsbA-MalQ融合蛋白,证明酶切后酶蛋白仍具有麦芽糖转糖基酶活性。该酶的最适温度为37℃,最适pH值为6.5。当处理温度小于40℃时,酶的活力基本保持在最高活性的80%以上,相对稳定;在酶的pH耐受方面,在pH5.5～8.0范围内较稳定。金属离子和EDTA对酶活性的影响实验表明,EDTA对酶活的影响不大,但Zn2 、Cu2 、Hg2 、Ag 对酶蛋白有较强的抑制作用,而Ca2 、Mg2 、Mn2 等对表达的酶有一定的激活作用。在37℃,pH6.5时以麦芽三糖为底物测得酶促反应的Km值为0.378mmol/L,Vmax值为1.979mmol/(L·min)。     

Egg White Lysozyme Purification by Ultrafiltration and Affinity Chromatography

Isolation and purification of lysozyme from hen egg white was studied using a two-step procedure. The egg white was diluted 5- to 9-fold with sodium phosphate buffer, and then processed by sequential dilution diafiltration using a UF membrane (molecular weight cut-off 300,000 dalton). The membrane process increased the specific activity of lysozyme 6-fold, and recovered 96% of lysozyme activity. The permeate from diafiltration was further purified by affinity chromatography using chitin as adsorbent. The second step of the process yielded a product of specific activity of 70,400 units/mg protein. The overall lysozyme recovery was 79%.