鼠抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高中和活性的鼠抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组TNF-α免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗TNF-α单抗,纯化后,用间接ELISA法和微量细胞病变MTT法检测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸铵洗脱法测定单抗的相对亲和力指数,并进行类及亚类、细胞染色体核型、特异性及稳定性检测。结果筛选出7株分泌抗TNF单克隆抗体的细胞株,其中6株具有较高的中和活性和良好的稳定性,其细胞上清及腹水的中和效价分别为1∶40～1∶160和(1～3)×10-4,7株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,5H10株与其余6株有不同的抗原表位,相对亲和力指数为0.4～1.5mol/L。结论已成功制备具有高中和活性的鼠抗TNF-α单克隆抗体,为抗人TNF-α嵌合抗体的构建奠定了基础。     

牛坏死杆菌43kDa外膜蛋白真核质粒在BHK细胞中的瞬时表达

目的构建含有牛坏死杆菌43 kDa外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)基因的真核表达重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP,并检测其在BHK细胞中的瞬时表达。方法将43 kDa OMP核苷酸全基因序列与pCAGGS-HA载体连接,构建重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP,转化至大肠埃希菌,将鉴定正确的阳性菌转染BHK细胞,采用间接免疫荧光和Western blot法检测重组蛋白的表达。结果经双酶切及PCR鉴定,重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP构建正确;转染pCAGGS-43 kDa OMP的BHK细胞镜下观察可见绿色荧光,Western blot检测可见相对分子质量为43 000的目的蛋白。结论成功构建了pCAGGS-43 kDa OMP真核表达质粒,可在BHK细胞中瞬时表达,为进一步研究牛坏死杆菌感染机制奠定了基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheities virus,IBRV)g E蛋白的单克隆抗体,并进行鉴定。方法将扩增的IBRV gE基因插入至载体p ET-32a(+),转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白IBRV gE,通过Ni-NTA Agarous Kit纯化后,免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,间接免疫荧光法筛选阳性杂交瘤细胞。经小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,3×10~6个/只,待小鼠腹腔膨大后,采集腹水,硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体,并进行亚类、浓度、染色体数目、Western blot及间接免疫荧光检测。结果重组蛋白IBRV gE相对分子质量约35 000,纯化后浓度为1.2 mg/mL。小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后,筛选出1株稳定分泌IBRV单抗的杂交瘤细胞(命名为3G9),获得相应抗体浓度为1.46 mg/m L;为IgG1亚类,轻链为kappa链;染色体数目为95~105;可与IBRV发生特异性反应;可与接种IBRV毒株的MDBK细胞发生特异性结合,产生特异性荧光。结论采用原核表达系统表达并纯化了IBRV gE蛋白,成功制备了抗IBRV gE的单克隆抗体,为建立特异性的IBRV诊断方法及致病机理的研究奠定了基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法将扩增的IBRV gD基因插入原核表达载体p ET-28a(+),构建重组质粒gD-pET-28a,转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白gD,通过Ni-NTA Agarous Kit纯化后,免疫BALB/c小鼠。取小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞,经小鼠腹腔注射,待小鼠腹腔膨胀时抽取腹水,用Hi Trap Protein G HP试剂盒纯化单抗,进行Western blot及间接免疫荧光检测。结果重组蛋白gD相对分子质量为48 000,纯化后浓度为4.19 mg/ml。小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后筛选出1株阳性杂交瘤细胞株,获得相应单克隆抗体的蛋白含量为1.81 mg/ml,且可与IBRV发生特异性反应,可与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光。结论本研究利用原核表达系统表达纯化了IBRV gD蛋白,成功制备了IBRV gD单克隆抗体,为下一步表位鉴定及致病机理的研究奠定了基础。     

抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheities virus,IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法采用超速离心纯化的IBRV全病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫后血清抗体呈阳性的小鼠脾细胞,通过融合剂PEG与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接免疫荧光法(IFA)筛选杂交瘤细胞,并制备腹水,分析单抗的生物学特性。结果筛选出1株稳定分泌抗IBRV gD蛋白单抗的杂交瘤细胞,命名为3C1。单抗的重链为IgG1亚类,轻链为kappa链;上清和腹水效价分别为1∶40和1∶12 800;单抗可与IBRV及gD重组蛋白分别在相对分子质量71 000和96 000处发生特异性反应,可与感染IBRV的MDBK细胞发生特异性结合,产生荧光。结论成功制备了抗IBRV gD蛋白的单克隆抗体,为深入研究gD蛋白功能及IBR的临床诊断方法筛选等提供了数据材料。     

河北省某牛场坏死杆菌的分离及鉴定

目的对河北省张家口市某牛场奶牛腐烂蹄肢部组织坏死杆菌进行分离及鉴定。方法采集17份奶牛腐烂蹄肢部组织,在苛养厌氧培养基中进行培养,培养液涂片进行革兰染色,提取细菌基因组DNA,PCR法鉴定病料组织培养物基因组DNA,并进行测序。纯化后细菌进行生化鉴定及药敏试验。结果病牛蹄组织革兰染色阴性,部分菌体呈杆状或长丝状;17份病牛蹄组织中共检测出7份坏死杆菌阳性样品;纯化后阳性菌液的生理生化特性与坏死梭杆菌基本一致;对亚胺培南(泰能)高度敏感,对氨苄西林/舒巴坦、红霉素、妥布霉素中度敏感,对克林霉素、青霉素G、氨苄西林、头孢唑啉、哌拉西啉耐药。结论该牛场确认发生腐蹄病疫情,且主要由坏死杆菌引起。     

单纯疱疹病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备单纯疱疹病毒的单克隆抗体。方法 用纯化的单纯疱疹病毒（HSV）抗原免疫雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得两株分泌抗单纯疱疹病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得单抗,检测该单抗的特异性。结果 这两种单抗与其他相关的病毒抗原无交叉反应,Western blot表明单抗均识别单纯疱疹病毒中相对分子质量50000的蛋白。结论 该单抗为单纯疱疹病毒的单克隆抗体。     

抗人肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体在CHO细胞中的表达及鉴定

目的在CHO细胞中表达抗人肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor-alpha,h TNF-α)人源单克隆抗体,并对抗体纯化后进行鉴定。方法将含有编码抗h TNF-α人源单克隆抗体轻、重链可变区及恒定区基因的真核表达质粒p HL,利用脂质体Lipofectamine TM 2000转染CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选和单克隆筛选,获得分泌表达抗h TNF-α人源单克隆抗体的CHO细胞株。应用Mab Select Su Re和Capto adhere两步层析纯化抗体后,分析抗体的纯度、N-末端序列、结合动力学平衡常数及中和活性。结果经两步层析后,抗h TNF-α人源单抗经SDS-PAGE分析,可见纯度较好的抗体重链、轻链和完整抗体条带,SEC-HPLC纯度为98.79%;抗体的轻、重链N-末端氨基酸序列与预期一致,其结合动力学平衡常数(KD)为1.34×10-10 M,能拮抗TNF-α对L929细胞的杀伤作用,对TNF-α细胞毒的中和率达90%左右。结论在CHO细胞中成功表达了具有较好中和活性的抗h TNF-α人源单克隆抗体。     

抗人GPA~N单克隆抗体的制备及鉴定

目的　制备抗GPA单克隆抗体以建立“GPA体细胞突变分析法”。方法　用O ,N型人红细胞 ,以及纯化人GPAN 免疫BALB/c小鼠 ,经杂交瘤技术制备 ,用细胞凝集、间接免疫荧光筛选 ,用ELISA、Westernblot、酶处理红细胞的间接免疫荧光标记鉴定。结果　获得抗GPAN 单克隆抗体 6A8杂交瘤细胞系。其单抗属lgG3亚类 ,λ型轻链 ,识别和结合GPAN 氨基端 1～ 8位决定位点 ,对糖链依赖。流式细胞分选结果显示 6A8特异结合二甲亚胺固定的人MN和N型红细胞。结论　对分析由于基因突变和糖基化变异所致N ,MN红细胞GPAN 突变有理论研究和应用价值。     

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段单克隆抗体的制备

目的制备抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段(sTRAIL)的单克隆抗体。方法用重组sTRAIL免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,捕获ELISA筛选阳性克隆,制备腹水抗体。间接ELISA测定单抗效价,并进行单抗亚类、特异性鉴定及杂交瘤细胞染色体和单抗识别位点分析。将杂交瘤细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后,检测细胞培养上清的效价。结果3株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgG1型,腹水单抗效价均高于10-6,杂交瘤细胞染色体数介于94～98条之间,均识别sTRAIL分子上线性表位。细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后的上清效价保持稳定。结论已成功制备了3株可稳定分泌抗sTRAIL单克隆抗体的杂交瘤细胞,为TRAIL的定性定量检测及组织表达分析奠定了基础。     

鼠抗人间变性淋巴瘤激酶单抗及其试剂盒的制备及鉴定

目的 制备并鉴定鼠抗人间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)单抗及其试剂盒.方法 以人ALK重组蛋白免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术制备人ALK单抗,ELISA及免疫细胞化学(immunocytochemical,ICC)法筛选稳定分泌ALK 单抗的杂交瘤细胞株;SDS-P...     

抗旋毛虫硒蛋白T单克隆抗体的制备及其对裸鼠肝癌H7402细胞的抑制效果

目的制备抗旋毛虫与肝癌H7402细胞相关抗原硒蛋白T单克隆抗体,并观察其对裸鼠肝癌H7402细胞的抑制效果。方法用纯化的旋毛虫硒蛋白T重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备其单克隆抗体;将肝癌H7402细胞经大腿内侧皮下接种BALB/c裸鼠,1×10^7个细胞/只,采用制备的高效价单抗,按20、50及100μg/只剂量接种裸鼠,隔日1次,共5次,评价单抗对裸鼠肝癌H7402细胞的抑制效果。结果成功获得了3株稳定分泌抗旋毛虫硒蛋白T的单抗的细胞株:4D4、4H2及4F1,效价均达1∶204800以上,其中4H2抗体效价最高;20、50及100μg/只剂量组的抑瘤率分别为51.6%、56.2%和80.3%。结论制备的抗旋毛虫与肝癌H7402细胞相关抗原硒蛋白T单克隆抗体对裸鼠体内肝癌H7402细胞具有明显的抑制效果。     

利福霉素单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立

目的制备利福霉素单克隆抗体,并建立利福霉素竞争ELISA检测方法。方法通过利福霉素与载体蛋白(BSA、OVA)偶联,制备免疫原和检测抗原,用杂交瘤技术制备单克隆抗体,建立利福霉素竞争ELISA检测方法。结果筛选出5株能稳定分泌抗利福霉素单抗的杂交瘤细胞株,均分泌IgG抗体,其中2H1、5H5、3F12和2C8株的轻链是κ链,3A2株的轻链是λ链;5株单抗为同一位阻群;在碱性条件下较稳定。建立的利福霉素竞争ELISA检测法灵敏度为6ng/ml,与利福平无交叉反应,稳定性良好。结论已成功制备了利福霉素单克隆抗体,并建立了利福霉素竞争ELISA检测法。     

泰乐菌素单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立

目的制备泰乐菌素(Tylosin)单克隆抗体,并建立泰乐菌素竞争ELISA检测方法。方法用羰基二咪唑将半抗原泰乐菌素分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备泰乐菌素免疫抗原Tylosin-BSA和检测抗原Tylosin-OVA,用紫外光谱扫描检测Tylosin-BSA偶联物,辣根过氧化物酶标记Tylosin-OVA偶联物。采用杂交瘤技术,制备特异性抗泰乐菌素单克隆抗体,建立泰乐菌素竞争ELISA检测方法。结果筛选出2株稳定分泌抗泰乐菌素单抗的杂交瘤细胞株3E4和2G10,2G10分泌的单抗腹水效价为6×10-4,抗体类型为IgG1型,轻链为κ链,在酸、碱及热条件下均较稳定。选择该单抗建立了泰乐菌素竞争ELISA检测方法。该方法灵敏度达50ng/ml,标准曲线线性关系良好(r=0.9827),且特异性、稳定性较好,准确性、精密性较高。结论已成功制备了泰乐菌素单克隆抗体,并建立了竞争ELISA检测方法,可用于动物源性食品中残留泰乐菌素含量的检测。     

14型肺炎球菌多糖单克隆抗体的制备与初步应用

目的制备14型肺炎球菌多糖单克隆抗体,并进行鉴定及初步应用。方法制备免疫原,免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,经3次亚克隆筛选单抗细胞株,并制备腹水。对筛选的单抗进行ELISA效价、特异性、亚型、中和效价、浊度法特异性等鉴定。采用制备的单抗腹水检测市售23价肺炎球菌多糖疫苗、7价肺炎球菌结合疫苗中14型肺炎球菌多糖含量,计算回收率;并与丹麦血清研究所(State Serum Institute,SSI)14型肺炎球菌多糖兔多抗血清检测结果进行比较,计算两者之间的变异系数(CV)。结果共获得7株14型肺炎球菌多糖单抗细胞株:PP-14-101~107,效价分别为105、104、104、104、105、105、105;7株单抗与23价肺炎疫苗中包含的除14型以外的其他所有血清型的多糖均不发生交叉反应;PP-14-101、104、105、106这4株单抗具有免疫浊度趋势,另3株单抗无浊度信号;PP-14-101和PP-14-104株单抗与6A、33F型肺炎球菌多糖具有一定的交叉反应,而PP-14-105和PP-14-106株单抗与23型多糖均无交叉反应;PP-14-101、PP-14-104株单抗为Ig M亚型,PP-14-105、PP-14-106株单抗为Ig G1亚型,PP-14-106比PP-14-105株单抗稀释倍数高,反应性更强,因此选择PP-14-106株单抗为目标单抗;PP-14-106株单抗腹水对14型肺炎球菌的中和效价远高于1∶17 496,中和效价较高;采用PP-14-106株单抗腹水检测市售23价肺炎球菌多糖疫苗和7价肺炎球菌结合疫苗,回收率为90.2%~120.0%,该单抗与SSI血清检测上述疫苗成品14型肺炎球菌多糖含量的CV值在2.5%~11.9%之间。结论成功获得1株效价高、具有杀菌活性、特异性好的单抗,该单抗具有免疫浊度趋势,能准确测定肺炎球菌疫苗中的多糖含量,可替代SSI血清用于多糖疫苗和结合疫苗中14型肺炎球菌多糖含量的定量检测。     

玉米赤霉烯酮抗独特型单抗的制备及特异性分析

目的制备并鉴定玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)抗独特型单抗Ab2β-1D5。方法将ZEN单抗1G4与载体蛋白KLH偶联作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合后,以ZEN单抗Fab片段作为包被抗原,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。经小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,制备腹水型单抗,并经Protein G亲和层析柱进行纯化。间接ELISA法检测ZEN抗独特型单抗的抗体效价及特异性;间接竞争ELISA法检测ZEN抗独特型单抗类型、灵敏度及其与ZEN毒素间的相关性。结果共获得6株稳定分泌ZEN抗独特型单抗的杂交瘤细胞株,腹水型抗体效价为1∶1.2×105～1∶2.0×105;6株单抗均为β型抗独特型抗体(Ab2β),其中Ab2β-1D5抗体灵敏度最高,对ZEN的IC50值达10.09 ng/ml,其与ZEN毒素呈线性相关(r=0.990);ZEN抗独特型单抗与莱克多巴胺、重金属铅、铬及虾过敏原单抗均无交叉反应,特异性良好。结论已成功制备玉米赤霉烯酮抗独特型单抗,该抗体与ZEN间存在"内影像"关系,可以替代ZEN毒素标准品,用于建立ZEN的无毒免疫学检测技术。     

抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠的制备及初步应用

目的制备抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠,并进行初步应用。方法采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗荧光素单克隆抗体;制备腹水,经50%硫酸铵粗提后,再经阴离子交换树脂DE52进一步纯化单克隆抗体;采用氧化共沉淀法制备纳米磁性粒子;乳液聚合法制备羧基磁性微球;用碳二亚胺将抗荧光素单克隆抗体共价偶联于磁性微球表面,制备抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠。用制备的免疫磁珠检测乙肝表面抗原,并与市售ELISA试剂盒的检测结果进行比较。结果共获得5株杂交瘤细胞株,其中1F12细胞株分泌的抗体效价、相对亲和力较高,特异性较好;纯化的1F12株单抗的纯度达95%,蛋白含量为2.4 mg/ml,ELISA效价为106,相对亲和力为0.2 mg/L,与FITC标记的BSA可特异性结合;纳米磁性粒子的平均粒径为150 nm,铁含量为71.63%;羧基磁性微球的平均粒径为210 nm,羧基含量约为2.15 mmol/g;每克羧基磁性微球可结合抗荧光素单克隆抗体约12 mg,制备的免疫磁珠可有效结合荧光素标记的蛋白。应用抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠检测乙型肝炎表面抗原的灵敏度高于ELISA试剂,检测限达0.1 ng/ml。结论成功制备了抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠,其具有应用于免疫检测分析的价值。     

抗人类共激活蛋白单克隆抗体的制备

目的制备抗人类共激活蛋白(CLP)单克隆抗体,并进行纯化。方法配制2×DMEM培养基,与等量的2.2%甲基纤维素溶液混合,加入HAT、胎牛血清等,配成半固体HAT选择性细胞培养基。用基因重组人CLP抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤NS-2细胞融合后,直接在半固体培养基上克隆化培养,筛选可持续、稳定、高效分泌抗CLP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对分泌的单抗进行鉴定后,制备小鼠腹水,经DEAE离子交换柱纯化,半饱和硫酸铵沉淀,G25凝胶过滤除盐。结果共筛选出14株分泌抗CLP单抗的杂交瘤细胞,其培养上清可与相对分子质量约16000的CLP抗原结合,抗体类型为鼠IgGa1型。多数克隆分泌的抗体相对亲和力大于1∶20000,14株克隆分泌的单抗分别对应3个抗原结合位点。纯化后的单抗纯度接近95%。结论已成功制备并纯化了抗人CLP单克隆抗体,为建立CLP免疫学检测方法奠定了基础。     

抗猪呼吸与生殖综合征病毒Nsp9蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗猪呼吸与生殖综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法用纯化的重组Nsp9蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9蛋白单克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验分析单抗的特异性;使用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒鉴定单抗的亚类;将杂交瘤细胞分别保存1、2、3、4个月后复苏,采用间接ELISA法检测细胞分泌抗体的能力。结果共获得3株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2D6、3C11和4E6,其细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶6 400、1∶3 200和1∶1 600,腹水的ELISA效价分别为1∶640 000、1∶512 000和1∶256 000。3株单抗均可与Nsp9蛋白和PRRSV特异性结合;2D6和3C11株单抗的Ig亚型为IgG1,4E6株单抗为IgM亚类抗体;3株杂交瘤细胞保存4个月均能稳定分泌单抗。结论已制备抗PRRSVNsp9蛋白单克隆抗体,其特异性高,稳定性良好,为建立鉴别自然感染与注射疫苗感染PRRSV的诊断方法提供了材料。