VC混菌发酵中大菌不同胞外组分对小菌的影响

在维生素C(VC)二步混菌发酵中,巨大芽孢杆菌可显著促进氧化葡萄糖酸杆菌产VC前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)。采用硫酸铵分级盐析沉淀、柱层析及电泳技术对巨大芽孢杆菌胞外液中的活性物质进行了分离纯化。通过测定氧化葡萄糖酸杆菌生长细胞转化L-山梨糖为2-KLG的生成量、产酸菌关键酶L-山梨糖脱氢酶(SDH)酶活性及产酸菌的活菌数,研究了VC两步发酵中大菌不同胞外组分对小菌的作用。结果表明:大菌胞外36 000和44 300两个组分蛋白质对小菌产酸、SDH酶活具有促进作用。     

L-山梨糖流加发酵高效生产2-酮基-L-古龙酸

混合菌系氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)和蜡状芽孢杆菌(cerus)能够在长时间内保持较强的代谢活力。在自动控制温度、PH和溶氧的条件下，探索间歇流加L-山梨糖发酵生成2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的新工艺。该工艺即充分利用了混合菌系的优良特性，又可解除糖的高浓度对产酸的抑制作用。通过本实验使L-山梨糖的终浓度达到14％，2-KLG产量为130mg／mL左右，转化率达90％，发酵周期40～60h之间。     

普通生酮基古龙酸菌2-酮基-L-古龙酸合成途径在氧化葡萄糖酸杆菌中的整合表达与强化

目前工业生产VC的方法为二步发酵法,但该法涉及两步3种微生物,存在操作工序繁琐、需要消耗大量原材料及能源等缺点。一步发酵法被认为能够降低生产成本并对VC的工业化生产起到革命性的改变。为了克服重组质粒易丢失及需要添加抗生素等不利因素,将普通生酮基古龙酸菌(K.vulgare WSH-001)中的山梨糖脱氢酶基因(sdh)和山梨酮脱氢酶基因(sndh)整合到氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans WSH-003)基因组,得到一步发酵生产菌株G.oxydans-ss。将其在1 L的罐中发酵,72 h时2-KLG产量达到最高,为37.6 g/L。为了进一步提高2-KLG的产量,还采用了辅因子工程。吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)是SDH和SNDH的辅酶,通过在G.oxydans-ss中过量表达来自K.vulgare WSH-001的pqq ABCDE基因,得到重组菌G.oxydans-ss/pqq ABCDE。将其在1 L的罐中发酵,84 h时2-KLG产量达到最高,为44.5 g/L。以上结果对VC的一步发酵起到了一定的促进作用,使一步发酵法生产VC的工业化生产有望实现。     

2-酮基-L-古龙酸一步发酵生产菌株发酵过程优化

对1株可以一步发酵生产维生素C直接前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KLG)的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌株(Gluconobacter oxydans–ss)的发酵条件进行优化,以提高其发酵效率。结合Box-Behnken实验和响应面法对其初始发酵培养基进行优化,得到优化的发酵培养基组成:山梨醇158.0 g/L,酵母膏18.0 g/L,初始p H5.0。采用该优化培养基在3 L全自动发酵罐上进行发酵过程控制。在考察不同转速对2-KLG积累过程影响的基础上,进一步提出分阶段转速控制策略:即发酵前期(0~48 h)转速控制在600 r/min,48 h至发酵结束转速控制在500 r/min。应用该策略,2-KLG产量达到34.86 g/L,生产强度为0.36 g/(L·h),其分别比恒定转速发酵时2-KLG的最大产量提高24.01%和24.14%。     

分阶段控制通风量提高2-酮基-L-古龙酸生产

考察发酵液中溶解氧对普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)和巨大芽胞杆菌(Bacillus magaterium)生长和产酸的影响,优化培养条件以提高维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的发酵收率。通过比较摇瓶条件下两菌生长和产酸曲线,提出了分三阶段控制通风量策略:即伴生菌巨大芽孢杆菌生长期(0～10h)、产酸菌氧化葡萄糖酸杆菌生长期(10h～25h)和古龙酸大量合成期(25h至发酵结束)。以菌体生长和产酸为衡量指标,对各阶段通风量进行优化,获得三阶段的最适装液量分别为95mL/750mL,95mL/750mL和70mL/750mL。通风量优化后的发酵结果较未优化前,其大菌生长速率、小菌生长速率和古龙酸的产量分别提高了14.7%、10.5%和10.9%。     

维生素C二步发酵菌发酵条件的优化

目的:改变发酵条件以提高发酵收率.方法:优化pH值、通风量、微量元素等发酵因子,找到最佳使用量.结果:发酵培养基中L-山梨糖起始浓度8%、碳酸钙浓度0.05%、复合VB以及分段调节pH值、通气量等可以有效地提高2-酮基-L-古龙酸的产量.结论:通过优化发酵条件可以优化发酵菌系的生理状态,促进大小菌之间的协调,使其达到最佳发酵状态.     

金属离子促进Gluconobacter oxydans高效合成2-酮基-L-古龙酸

根据Gluconobacter oxydans合成2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)代谢途径采用单因素实验研究了6种金属离子对细胞生长和2-KLG的影响,在此基础上,对促进细胞生长或产酸的Mg2+、Mn2+、Fe3+建立多元二次方程模型,得到上述3种金属元素的最佳浓度为Fe3+0.21 mmol/L,Mn2+9.98 mmol/L和Mg2+4.23 mmol/L。在这一最优组合下,2-KLG产量达到65.1 g/L,与优化前比较,提高了144.4%。     

响应面法优化VC二步混合菌新菌系发酵培养基

为提高VC二步发酵法中糖酸转化过程的产酸量,本实验室从新鲜牛奶中筛选出一株高效促产酸菌生长和产酸的伴生菌——枯草芽孢杆菌A9。在单因素试验基础上,采用响应面法对发酵培养基成分进行优化。结果表明,L-山梨糖、玉米浆、尿素的影响比较显著,最佳培养基条件为L-山梨糖90g/L、尿素12.2g/L、玉米浆14.2g/L、CaCO34.1g/L、MgSO40.2g/L,可获得2-酮基-L-古龙酸产量为69.74g/L,与理论值70.33g/L的相对误差为-0.59g/L。曲面回归方程与实验结果拟合性较好,此模型合理可靠,可用于实际预测。优化后的培养基比原培养基平均提高2-KGA产量17.4%。     

谷氨酸高产菌GDK-9的定向选育及其发酵过程研究

以天津短杆菌GDK6为出发菌株,通过原生质体紫外诱变、紫外诱变和硫酸二乙酯(DES)诱变定向选育L-谷氨酸生产菌。经摇管初筛、摇瓶复筛、遗传标记验证、单菌落分离和连续传代,最终筛选出1株L-谷氨酸高产菌GDK-9。该菌株在未优化条件下摇瓶发酵42h产L-谷氨酸79.2g/L。另外,试验结果证实GDK-9菌株的遗传标记和产酸能力十分稳定。在优化条件下,通过7L罐发酵32h,谷氨酸产量达131.5g/L,糖酸转化率达到62.2%。     

基于Gluconobacter oxydans膜结合脱氢酶的静息细胞催化合成2-酮基-D-葡萄糖酸

基于G.oxydans DSM2003膜结合葡萄糖酸-2-脱氢酶（GA-2-DH）的催化特性,利用静息细胞催化技术合成D-异抗坏血酸（EA）的主要前体2-酮基-D-葡萄糖酸（2-KGA）。利用高浓度底物自适应筛选技术,筛选到高产2-KGA菌株并对其摇瓶催化进行优化,优化后最适条件为：温度30℃,pH6.0,细胞浓度20g/L,底物浓度1100mmol/L,摇床转速250rmin,此时时空产率为24.68mmol/L/h;摇瓶优化工艺基础上在7L发酵罐中对重点影响参数（转速与底物浓度）进行了进一步优化,优化后2-KGA的时空产率提高到74mmol/L/h,并且催化细胞可有效重复利用3次。     

利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌产丙酮酸研究

丙酮酸是一种重要的有机酸,可以作为前体物质,参与合成多种有机化合物,在生物体的能量代谢中发挥着重要作用。为提高丙酮酸产量,选择利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)生产丙酮酸。利用同源重组的方法,依次敲除谷氨酸棒杆菌中与丙酮酸代谢支流相关的5个关键基因(丙酮酸醌氧化还原酶基因pqo、丙酮酸羧化酶基因pyc、转氨酶基因alaT、缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶基因avtA、丙酮酸脱氢酶基因aceE),摇瓶发酵72h后丙酮酸的产量达到14.64g/L。通过过表达编码转酮醇酶基因tkt、转醛酶基因tal、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pck,增加合成丙酮酸前体物质的供应。最终,复合培养基摇瓶发酵72h后,发酵液中丙酮酸的产量达到15.39g/L,与野生型菌株相比提高了28倍。研究旨在为利用微生物发酵生产丙酮酸提供一定的理论参考。     

氧化葡萄糖酸杆菌发酵L-山梨糖工艺

为了实现L-山梨糖的高效生产,利用代谢改造的手段构建获得一株过量表达山梨醇脱氢酶基因(sldhAB)的重组菌氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans SLDH)。利用海藻酸钠和硅藻土包埋法固定化细胞,并在1 L发酵罐中对发酵条件和补料策略进行了优化,通过对发酵过程中底物消耗进行数学模拟,最终建立了分批补料发酵工艺。研究发现,和野生菌相比,在1L发酵罐水平上重组菌L-山梨糖的产量提高了20.3%,且发酵周期缩短了1/3以上。利用固定化重组菌进行分批补料发酵可完成19 d的补料发酵,其L-山梨糖净累积量比野生菌提高了30.3%。     

Metabolic engineering study on the direct fermentation of 2-keto-L-gulonic acid, a key intermediate of L-ascorbic acid in Pseudomonas putida IFO3738

We have achieved production of 2-keto-L-gulonic acid (2-KLGA) in recombinant Pseudomonas putida IFO3738. Firstly, the genes for sorbose dehydrogenase (SDH)/sorbosone dehydrogenase (SNDH) were introduced into P. putida. The recombinant P. putida/pBBR-SDH produced 0.7 mg/ml of 2-KLGA in a culture broth containing 5% L-sorbose. Replacement of the native SNDH promoter by the Escherichia coli tufB promoter (pBBR-SDH-tufB) improved the productivity of 2-KLGA up to 11.4 mg/ml. Secondly, the sorbitol dehydrogenase (SLDH) gene was also introduced into P. putida. The recombinant P. putida/pUCP19-3DH carrying the genes for SDH, SNDH and SLDH had the ability to produce 2-KLGA (7.5 mg/ml) in a 5% d-sorbitol broth. The productivity of 2-KLGA was improved up to 9.8 mg/ml by changing to an expression system with two plasmids, pBBR-SDH-tufB (for SDH/SNDH) and pUCP19-SLDH (for SLDH), respectively. Moreover, the replacement of the native SLDH promoter by the E. coli tufB promoter (pUCP19-SLDH-tufB) improved the 2-KLGA productivity up to 11.6 mg/ml. Optimization of cultivation conditions increased the conversion yield of 2-KLGA to 32% and that of l-idonate, a metabolite of 2-KLGA, to 40%. These results indicate P. putida IFO3738 is one of the candidate strains for direct fermentation of 2-KLGA.     

响应面法优化少根根霉发酵合成富马酸

利用少根根零发酵生产富马酸,考察了不同浓度的初始葡萄糖以及有机氟源酵母膏和无机氮源(NH_4)_2SO_4对富马酸的合成的影响。在此基础上运用响应曲面分析方法优化了富马酸产量以及转化率,葡萄糖和(NH_4)_2SO_4的浓度为162.0g/L、3.08g/L时,富马酸的产量最大为75.15g/L;葡萄糖和(NH_4)_2SO_4的浓度为121.2g/L、2.23g/L时,富马酸的转化率最大为55.16%,在原来基础上产量有了明显的提高,优化效果较好,通过验证实验值与预测值基本相符。     

代谢工程优化大肠杆菌高效合成L-苯丙氨酸

为获得1 株稳定高产的L-苯丙氨酸工程菌株,利用规律间隔成簇短回文重复序列/Cas9技术,在大肠杆菌W3110中引入己解除反馈抑制的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶PheA,随后利用不同强度的启动子对莽草酸途径中各反应酶进行调控,并通过摇瓶发酵确定了莽草酸途径各步反应酶的最适表达强度,最后通过增加前体物磷酸烯醇式丙酮酸供应,...     

高产酵母菌株(Rhodotorula bacarum)产普鲁兰多糖过程中搅拌和通气条件的优化

在过去的研究中发现普鲁兰多糖高产酵母菌株摇瓶发酵的最佳条件是 180r/min ,2 8℃ ,6 0h ,在此条件下该菌株可以产生质量体积分数为 5 9%的普鲁兰多糖。本文研究发现在 5L发酵罐中通气量和搅拌速度对该酵母菌株的普鲁兰多糖产量有很明显的影响。研究结果表明产普鲁兰多糖的最适通气量和搅拌速度分别是6 . 5L/min和 30 .0r/min。相应的 ,用每升含 80g的葡萄糖做发酵培养基 ,在 2 8℃条件下培养 72h ,其普鲁兰多糖的产量质量体积分数为达到 7. 5 % ,这是迄今为止所报道的产普鲁兰多糖酵母中产量最高的菌株。作者发现这株酵母菌产普鲁兰多糖高效合成过程的原因是其有很高的葡萄糖转化率。     

基于ARTP技术选育维生素K2优势菌株及发酵培养基优化

本研究目的在于获得维生素K₂优势突变株,并利用响应面设计优化发酵培养基进一步提高其产量。采取常压室温等离子体诱变技术结合结构类似物抗性初筛、24孔板发酵复筛,对纳豆芽孢杆菌进行诱变选育,并应用Box-Behnken设计对发酵培养基进行优化。通过ARTP诱变选育得到一株维生素K₂优势突变株,维生素K2产量较初始菌株提高了3.23倍。Box-Behnken实验优化后,最佳值为K₂HPO₄（0.69 g/L）,甘油（66.01 g/L）和酵母粉（25.12 g/L）,发酵后维生素K₂产量较优化前提高了56.7%。通过ARPT技术诱变选育出一株维生素K2优势突变株,采用响应面法优化发酵培养基。实验结果表明,突变株具有潜在的生产应用价值,建立的育种方法也可为其他工业微生物的选育提供有益的参考,对提高人们的健康水平具有十分重要的意义。     

Thermobifida fusca WSH03-11突变株合成角质酶的发酵条件

以放线菌Thermobifida fusca WSH03—11——高产角质酶突变株为出发菌株，在摇瓶中考察了碳、氮源等条件以及接种量、装液量和初始pH值等环境条件对突变株细胞生长和产角质酶的影响。通过优化发酵条件，突变菌株的角质酶酶活达10．1U／mL，提高了15％。在此基础上，在5L发酵罐中进一步研究了碳源流加对突变株发酵产酶的影响，结果发现，分别在0、24、48h添加1％乙醇，角质酶酶活达到16．4U／mL，细胞干重（DCW）达到3．7g／L，而且发酵时间也由110h缩短到50h。     

维生素对L.delbrueckii乳酸发酵的影响及其优化

研究了维生素对Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ生长及产酸的影响，结果表明生物素、对氨基苯甲酸和硫胺素对Ｌ、ｄｅｌ－ｂｒｕｅｃｋｉｉ的生长及产酸有促进作用。用响应面分析方法对生物素、对氨基苯甲酸和硫胺素添加量进行优化，建立了响应面方程，得到了最佳组成；生物素２．１９ｍｌ／Ｌ、对氨基苯甲酸 ２．２５ｍｌ／Ｌ、硫胺素２．０５ｍｌ／Ｌ。乳酸最大产量为 ９４．６５ｇ／Ｌ。考察了添加维生素的间歇发酵，结果表明菌体繁殖快。生物量高、降糖快、发酵结束无残糖、乳酸产量高。乳酸最高产量为９２．５ｇ／Ｌ，与优化的预测结果基本一致。