日本血吸虫新型疫苗的研究进展

日本血吸虫病是一种严重危害人类及家畜健康的人兽共患寄生虫病,研制疫苗是防治血吸虫感染的有效措施。传统疫苗因成本高、免疫原性低及存在安全隐患,使其应用受到限制,开发新型疫苗成为必然趋势。随着免疫学和分子生物学的快速发展,近年来出现了各种新型疫苗。本文就基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗、重组活载体疫苗和抗独特型抗体疫苗的研究进展、各新型疫苗的优缺点及应用前景作一综述。     

大肠杆菌hCG核酸疫苗质粒扩增营养条件研究

采用摇瓶实验考察了营养条件对大肠杆菌hCG核酸疫苗质粒含量的影响。结果表明,甘油是质粒DNA生产的最佳碳源;C/N比对质粒DNA含量影响明显。向改良的PDM培养基中添加3 g.L-1的柠檬酸钠,可以降低糖酵解途径的代谢通量,使质粒含量达到11.73 mg.L-1,提高了20%。氟化钠是糖酵解途径的抑制剂,在菌体生长8 h后,向改良的PDM培养基中添加浓度为120 mg.L-1的氟化钠,培养后质粒DNA含量为12.09 mg.L-1,提高了29%。进一步研究发现乙醇对质粒DNA含量影响显著,在改良的PDM培养基中添加2 g.L-1的乙醇,可使质粒DNA含量达到12.94 mg.L-1,提高了32%。     

基因疫苗用质粒DNA生产下游工程的概述

<正> 基因治疗的研究和基因疫苗的开发被认为是人类医学史上的两大突破。第一批基因治疗药品很快将要面市,预计到2010年,此类药品的市场收益将达到45000000$。这两种技术都需要通过载体将外源基因导入宿主细胞并整合在宿主基因上,通常使用的载体有病毒载体和质粒DNA载体,其中病毒载体在安全性方面存在不少隐患,例如可能激活致癌基因,因此人们将开发的重点放在质粒DNA载     

培养基组分对hCG核酸疫苗质粒拷贝数的影响

研究了培养基组分对hCG核酸疫苗质粒拷贝数的影响.结果表明,复合培养基比合成培养基更利于hCG核酸疫苗质粒DNA的生产.通过均匀设计实验确定,当培养基中含有胰蛋白胨10 g·L-1、酵母浸出粉8 g·L-1、NaCl 10 g·L-1、甘油10 g·L-1、KH2PO40.37 g·L-1、 K2HPO4 2.01 g·L-1时,单位菌体质粒含量可达6.68 mg·g-1;在此基础上添加乙酸2.0 g·L-1、谷氨酰胺1.2 g·L-1、甘氨酸1.0 g·L-1、天门冬氨酸0.4 g·L-1,可使质粒拷贝数进一步扩增,单位菌体质粒含量可达9.32 mg·g-1,为LB培养基的5.12倍.     

治疗性双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺研究

目的研究双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法首先通过计算质粒拷贝数,检测工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在传代过程中的遗传稳定性,通过摇瓶培养确定培养基组成,再在30L发酵罐内,通过改变培养基成分、培养时间、补料方式,确定最佳发酵参数。并将确定的最佳发酵参数应用于50L发酵罐连续3批中试规模的发酵,同时考察在发酵培养过程中质粒稳定性和超螺旋质粒DNA的比例。结果工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在连续传代30次后,质粒拷贝数保持稳定。确定最佳发酵参数为以甘油为碳源的培养基培养,梯度恒速流加方式补料,培养时间为10h。通过3批稳定发酵,最终可获得湿菌58.0~71.8g/L,质粒含量可达到1.11~1.58mg/g菌,超螺旋质粒DNA的比例达93%以上。结论已建立了稳定的双质粒HBV DNA疫苗工程菌中试发酵工艺,为进一步规模化生产奠定了基础。     

重组质粒DNA D-GPEi工程菌发酵工艺的优化

目的优化重组质粒D-GPEi工程菌发酵工艺条件。方法控制相关发酵参数,观察溶解氧浓度、比生长速率和培养时间对工程菌生长和质粒浓度的影响。结果发酵培养对数生长期溶解氧浓度控制在30%~50%。补料前比生长速率为0.5~0.7/h,6 h开始补料,比生长速率下降,12 h后比生长速率为0.1~0.2/h。连续发酵3批工程菌,21 h后收集菌体,得到菌体平均产量为89.4 g/L(A=52.6),质粒平均产量为359.8 mg/L。3批工程菌浓度和质粒拷贝数差异无显著意义。结论此发酵工艺得到工程菌浓度和质粒拷贝数较高,重复性好,适用于大规模工业化生产。     

核酸疫苗载体pVAX-44质粒高拷贝研究

研究了质粒复制的前体物质、蛋白质合成抑制剂及金属离子对核酸疫苗载体pVAX-44质粒拷贝数的影响.结果表明,在改良的LB培养基中分别添加谷氨酰胺、甘氨酸、天门冬氨酸和Fe3 时,单位菌体质粒含量分别达到5.88 mg·g-1、7.15 mg·g-1、5.93 mg·g-1、7.38 mg·g-1,同时添加这几种物质时,质粒拷贝数可以得到进一步扩增.均匀设计实验结果表明,改良的LB培养基中含有1.6 g·L-1甘氨酸、1.0 g·L-1天门冬氨酸、0.2 g·L-1谷氨酰胺、0.4 mmol·L-1 Fe3 时,单位菌体质粒含量可达到9.11 mg·g-1,明显高于单独添加这几种物质时的质粒拷贝数.在此基础上加入0.1 g·L-1链霉素抑制蛋白质合成,单位菌体质粒含量可达到9.53 mg·g-1,较对照提高了56.25%.     

发酵培养中葡萄糖对超螺旋质粒DNA产量的影响

本文首先研究了含有不同质量浓度葡萄糖的发酵培养基对超螺旋质粒DNA产量的影响。结果表明,发酵培养基中最佳葡萄糖的质量浓度为2 00g L。此培养基与未添加葡萄糖的培养基相比,超螺旋质粒DNA产量提高2 56倍;菌体密度提高1 26倍。其次研究了优化培养基下影响超螺旋质粒DNA产量的各参数变化规律。     

重组HIV-1 DNA疫苗工程菌中试发酵工艺的优化

目的优化重组HIV-1DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法优化质粒转化条件,制备工程菌Jm109/pVAX1-MEGp24种子液,连续传30代,检测其遗传稳定性;优化培养基成分、补料基质、补料方式和培养时间,确定最佳发酵参数;并应用最佳发酵参数,于50L发酵罐进行3批中试规模的发酵,考察在发酵培养过程中质粒的稳定性和超螺旋质粒的比例。结果工程菌在连续传代30次后,质粒拷贝数基本保持稳定;最佳发酵参数为:采用以甘油为碳源的培养基,以梯度恒速流加方式补料,培养时间13h;通过3批稳定发酵,最终可获得湿菌67.0～68.6g/L,质粒含量可达1.62～1.73mg/g菌,超螺旋质粒的比例达93%以上。结论已建立了稳定的重组HIV-1DNA疫苗工程菌中试发酵工艺,为进一步规模化生产奠定了基础。     

治疗性双质粒HBV DNA疫苗制剂的稳定性

目的考察治疗性双质粒HBV DNA疫苗制剂A、B的稳定性。方法按照《中国药典》三部(2010版)方法,对治疗性双质粒HBV DNA疫苗制剂A、B分别进行影响因素试验、加速试验、长期试验,在不同条件下考察样品的基本性状,特别检测质粒DNA的超螺旋比例及进行细胞学转染试验和体内药效学试验。结果双质粒HBV DNA疫苗制剂在破坏性因素的影响下,于光照(4 500±500)Lx、高温(40和60℃)、反复冻融(-20℃←→4℃和-20℃←→RT)条件下5 d均不稳定;匀速振动(140和240 r/min)10 d不稳定;在(25±2)℃、相对湿度(60±10)%的条件下放置1个月不稳定;在温度2~8℃条件下放置2年保持稳定。结论双质粒HBV DNA疫苗制剂对光照、温度敏感,应避光低温保存,避免反复冻融,适合现代快速长途运输,长期保存应在2~8℃条件下,暂定二年有效期,为治疗性双质粒HBV DNA疫苗的临床用样品的运输和保存提供了依据。     

日本血吸虫亮氨酸氨基肽酶的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化日本血吸虫亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase of Schistosoma japonicum,SjLAP)。方法从日本血吸虫成虫中RT-PCR扩增LAP基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组SjLAP蛋白(rSjLAP)经SDS-PAGE和Western blot分析后,经His Binding Purification Kit层析纯化,纯化的rSjLAP蛋白经SDS-PAGE分析纯度,Bradford法测定浓度。结果克隆的SjLAP基因与GenBank中登录的基因序列比较有2个碱基发生置换,导致对应的2个氨基酸发生置换,但均不在关键区域;重组表达质粒pET-28a/SjLAP经双酶切鉴定证实构建正确;表达的rSjLAP蛋白相对分子质量约45 000,诱导4 h表达量最高;纯化的rSjLAP蛋白纯度较高,浓度达5.0 mg/ml,并可被抗小鼠His-tag单抗及血吸虫感染的患者血清和兔血清特异性识别,具有良好的反应原性。结论成功在大肠杆菌中表达了rSjLAP蛋白,纯化的rSjLAP纯度较高,为血吸虫病的诊断和预防等研究奠定了基础。     

质粒DNA的大规模制备

质粒ＤＮＡ有重要的基因调节性能,直接注射裸露或用脂质体包埋的质粒ＤＮＡ常需要大量的质粒ＤＮＡ。当前广泛被采用的碱溶从细胞中提取质粒的方法有不少问题,其中纯化工艺产量较低是质粒大规模生产的主要瓶颈,因此设计和开发新型质粒生产方法具有重要的意义。     

产壳聚糖酶微生物的筛选及产酶条件的优化

目的 从土壤中筛选能降解壳聚糖的微生物,并优化其产酶条件。方法利用平板筛选法对采集的土壤中的微生物进行富集培养、初筛和复筛,得到能降解壳聚糖的菌株,并对降解壳聚糖能力最强的菌株进行发酵培养,优化产酶条件。结果筛选出3株产壳聚糖酶菌株,编号为C-01、C-02和C-03,其中,C-01、C-02为细菌,C-03为霉菌。C-01菌株产酶能力最强,其最适产酶条件为:以1%粉末壳聚糖+0.1%葡萄糖为碳源,0.5%(NH4)2SO4+0.5%蛋白胨为氮源,培养基初始pH值8.0,培养温度30℃,菌株接种量2.0%,培养时间48 h。在最适条件下,壳聚糖酶活力可达7.78 U/ml。结论已筛选出1株高产壳聚糖酶的菌株,并优化了其产酶条件,为壳寡糖的生产及应用奠定了基础。     

蛋白酶产生菌的筛选及发酵条件的优化

筛选了植物蛋白加工用蛋白酶产生菌,为酶的分子改造和植物蛋白加工提供材料基础。通过不同菌株筛选,获得了一株蛋白酶的高产菌株枯草芽孢杆菌X12。经过单因子实验,确立了产酶的最适培养基配方:蔗糖7.5 g/L,黄豆粉6.0 g/L,MnSO40.04 g/L,初始pH=7.0,装液量75 mL/250 mL。结论:按照所优化的产酶条件于37℃,180 r/min,经60 h培养,发酵液最终酶活达1 868.4 u/mL。     

嗜水气单胞菌J-1株灭活疫苗生产工艺的改进

目的 改进嗜水气单胞菌J-1株灭活疫苗的生产工艺,提高培养效率.方法 采用改良培养基和产毒素培养基,利用机械式通风搅拌培养J-1菌株.确定发酵培养时间,并比较两种培养基的培养效果;用摇瓶灭活和罐灭活J-1菌株培养液,比较不同浓度甲醛的灭活效果.结果 用机械搅拌发酵罐培养J-1菌株,菌体生长12～14 h达峰值,产毒素培...     

DNA疫苗及其在传染病控制中的应用

疫苗在人类抵御传染性疾病的过程中扮演着重要角色,DNA疫苗在应对突发性新型传染病方面具有独特的优势。近年来,随着对DNA疫苗研究的不断深入,DNA疫苗的安全性和有效性均得到了极大的提高。虽然目前尚无人用DNA疫苗应用于临床,但在畜牧养殖业已有了初步的探索。本文对DNA疫苗的发展及其作用机制、优势、安全性、改进及其临床应用情况作一综述。     

重组日本血吸虫14-3-3蛋白的纯化和鉴定

目的观察两次切胶、两次电洗脱的方法纯化重组日本血吸虫14-3-3(Sj14-3-3)蛋白的效果。方法采用两次切胶、两次电洗脱的方法(与经典的切胶、电洗脱有所不同),纯化Sj14-3-3蛋白,并与柱层析纯化方法进行比较。结果采用两次切胶、两次电洗脱方法纯化的目的蛋白条带单一,浓度达3mg/ml,而柱层析法纯化的蛋白浓度仅为1mg/ml。Western blot证实纯化目的蛋白的特异性。结论两次切胶、两次电洗脱法可获得高纯度、高特异性的目的蛋白,不失为一种经济有效的蛋白纯化方法。     

日本血吸虫重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠心肌梗死预后的影响及其免疫调节机制

目的 探讨日本血吸虫重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂(rSjcystatin)对小鼠心肌梗死(myocardial infarction,MI)预后的影响及其免疫调节机制.方法 建立小鼠MI模型,分别于术后1、3、5、7、14、28 d经腹腔注射PBS及10、25 μg rSjcystatin.术后28 d,记录MI小鼠的生存...