霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及基本性质的研究

对霍山石斛(Detrdrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng)中的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL EC.4.3.1.5)进行了部分分离纯化和性质研究,取组织培养试管苗经过冰浴研磨、硫酸铵分级沉淀、DE-52阴离子交换层析,分离纯化苯丙氨酸解氨酶.经过测定,苯丙氨酸解氨酶的纯化倍数为2.33,蛋白质得率0.41%,酶得率1%.霍山石斛苯丙氨酸解氨酶在硼酸缓冲液中最适PH为8.4,PAL最适反应温度为45℃.霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的最适底物浓度为2mmol/L,有两个Km值,即Km1为0.4425×10-2mol/L,Km2为0.847×10-4mol/L.     

L-苯丙氨酸解氨酶产生菌分离及酶促反应研究

从土壤中分离出具有较高活力的苯丙氨酸解氨酶产生菌株——酵母菌SAl。对其酶的诱导合成以及转化肉桂酸生产L-苯丙氨酸条件进行了优化。结果表明，L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-异亮氨酸作为诱导物及联合使用均能提高L-苯丙氨酸解氨酶的酶活力单位，其中L-酪氨峻的诱导性最好：最佳酶促反应条件为：2．0％反式肉桂酸，碳酸氢铵：氨水（W：V）=4：4，pH10．6，34℃，反应时间8h；往转化体系中添加甘油对酶活力有较好的保护作用。     

非离子表面活性剂双水相萃取氨基酸研究

该文对氨基酸萃取液在非离子表面活性剂双水相体系中的萃取分配相行为进行研究。采用脂肪醇聚氧乙烯醚AEO–7/盐双水相萃取L–苯丙氨酸,考察了加盐(NaCl、Na2SO4、Na3PO4)、AEO–7含量、萃取时间、加入萃取物L–苯丙氨酸的含量以及萃取温度对双水相及萃取分离L–苯丙氨酸的影响。结果表明,AEO–7/Na3PO4双水相萃取L–苯丙氨酸的适宜条件是当AEO–7的体积浓度为8%,Na3PO4·12H2O的质量浓度为85 g/L,温度为40℃,L–苯丙氨酸的质量浓度为0.532 8 g/L,时间为60 min时L–苯丙氨酸的萃取率可以达到98.7%,分配系数为15.3。     

利用环糊精糖基转移酶转化合成AA-2G的研究

利用环糊精糖基转移酶(CGT-SL)对转化合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的条件进行考察。反应产物通过HPLC/LC-MS分析确定含有AA-2G。以便宜易得的可溶性淀粉和VC作为底物,在初始反应条件下AA-2G的产量为1.23 g/L。通过转化条件优化初步确定了转化反应的最优条件:最适温度15℃,最适pH 4.0,转化反应时间32 h,底物VC和可溶性淀粉的比例为2∶4,VC质量浓度为16 g/L,酶浓度为79 U/m L时,AA-2G的产量达到6.23 g/L,VC转化率为19.93%。     

山药苯丙氨酸解氨酶特性的研究

本文研究了山药苯丙氨酸解氨酶(PAL)的动力学特性。结果表明,PAL最适底物浓度为1mmol/L,底物浓度过高或过低都对酶活力不利。PAL在硼酸-氢氧化钠缓冲液中适宜的pH范围为7.6～9.2,最适pH有2个:pH8.0和pH8.8。PAL不耐酸碱,尤其不耐碱。PAL适宜的温度范围为35～55℃,最适反应温度为45℃,超过70℃则容易钝化。L-酪氨酸和L-半胱氨酸对PAL活性都有抑制作用,抑制程度随抑制剂浓度增加而增强。L-酪氨酸的抑制作用较强,是PAL的竞争型抑制剂。L-胱氨酸对PAL的活性无影响。     

重组果聚糖蔗糖酶的发酵优化及应用

为了研究不同条件下重组短小芽孢杆菌产果聚糖蔗糖酶的最适条件以及利用重组酶转化蔗糖-乳糖制备低聚乳果糖的最适转化条件。以前期构建的产果聚糖蔗糖酶重组短小芽孢杆菌Brevibacillus brevis/pNCMO2-lsc作为菌种,通过单因素试验以及正交试验确定其最适产酶的发酵培养基为:葡萄糖20 g/L、氮源(工业酵母粉∶棉籽粉=2∶1,质量比)为40 g/L、CaCl_20.5 mmol/L,最适产酶温度30℃。在最优条件下发酵培养,果聚糖蔗糖酶的酶活可达62.1 U/mL,是优化前的3.69倍。利用该重组果聚糖蔗糖酶转化蔗糖-乳糖制备低聚乳果糖,在蔗糖和乳糖质量浓度均为200 g/L情况下,确定其最适转化条件:反应温度35℃,pH 6.0,加酶量为2 U/g底物,反应8 h后低聚乳果糖转化率可达39.1%。     

固定化苯丙氨酸脱氨酶拆分D,L苯丙氨酸制备D苯丙氨酸

为了建立新的D-苯丙氨酸生产工艺,对固定化苯丙氨酸解氨酶(PAL)拆分D,L-苯丙氨酸进行了研究。以介孔材料(MCM-41)为载体固定PAL,将其用于拆分消旋体D,L-苯丙氨酸制备高光学纯的D-苯丙氨酸。最佳的固定化条件是载酶量为50mg/g、壳聚糖浓度为0.1%(w/v)、戊二醛浓度为0.05%(v/v),固定化酶的活性达到最大,酶活保留达到92%,重复利用20次后,活性仍能保持85%。将制备的固定化酶应用于D,L-苯丙氨酸的拆分,反应24h L-苯丙氨酸转化率达到98%,D-苯丙氨酸的ee值达到96%,且连续拆分10个批次后固定化酶对L-苯丙氨酸的转化率仍保持在95%以上。因此,高效稳定的固定化PAL在拆分D,L-苯丙氨酸生产D-苯丙氨酸中具有良好的应用前景。     

高压静电场法制备壳聚糖－L-苯丙氨酸微囊

采用高压静电场法制备壳聚糖-L-苯丙氨酸微囊。以包封率为优化目标,得到最佳制备条件为温度30℃、壳聚糖浓度5.0%、L-苯丙氨酸浓度1.0%、氢氧化钠浓度0.75 mol/L、电压10 kV、转速450 r/min、下滴高度11 cm。在此条件下制得的微囊包封率为66.9%,载药量为0.58%。L-苯丙氨酸微囊化后稳定性有较大的提高。微囊表面布满小孔,有利于L-苯丙氨酸的缓释。     

冬枣果实苯丙氨酸解氨酶酶学特性的研究

研究了冬枣果实苯丙氨酸解氨酶(PAL)的酶学特性。L-苯丙氨酸为枣果实PAL的反应底物,结果表明,最适底物浓度为1.0 mmol/L。枣果实PAL属于别构酶,具有2个米氏常数,Km分别为0.115×10-4、8.177×10-4 mol/L。枣果实PAL最适温度为50℃,最适p H为8.8。在浓度为0~4.0 mmol/L范围里,L-半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸均对枣果实PAL活性有一定的抑制作用,而抗坏血酸和蔗糖对PAL有激活作用。金属离子对PAL激活作用由强到弱依次为:Cu2+Fe3+Fe2+Na+;金属离子对PAL抑制作用由强到弱依次为:Al3+Mg2+Mn2+Ca2+Zn2+K+。研究结果揭示了冬枣果实PAL酶学特性,为通过调控枣果实PAL酶活性改善果实贮藏特性提供了理论依据。     

二步法酿造β-苯乙醇调味酒的工艺优化

在酿酒酵母转化L-苯丙氨酸合成β-苯乙醇的基础上,通过紫外诱变育种、好氧发酵与补料厌氧发酵的二步法工艺来研制β-苯乙醇调味酒。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GIM2.35为出发菌种,进行两轮紫外诱变,筛选获得1株较初始菌株合成β-苯乙醇能力提高了13.6%的诱变菌株UV-15-15;通过单因素试验,获得好氧发酵优化工艺条件为麦芽汁11°P,L-苯丙氨酸5 g/L,发酵24 h,此时β-苯乙醇质量浓度为1.69 g/L,较优化前提高了6.3%;补料厌氧发酵工艺优化条件为补料比例1∶4,补料液L-苯丙氨酸含量5 g/L,巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)接种量3%(V/V),发酵8 d,酒精度11.2%vol,乙酸含量0.37 g/L,β-苯乙醇质量浓度为1.17 g/L,蒸馏酒感官评分为8.9分。     

唾液链球菌嗜热亚种Y-2细胞转化法制备γ-氨基丁酸

研究反应pH值、反应温度、重金属盐、表面活性剂、底物浓度、菌体质量浓度和磷酸吡哆醛添加量对Streptococcus salivarius subsp.thermophilus Y-2细胞转化法生产γ-氨基丁酸的影响。获得反应体系的最佳组成为:湿菌体25g/L、BaCl2 40mmol/L、Triton X-100体积分数0.02%、L-谷氨酸单钠盐(L-monosodium glutamate,MSG)47.5g/L和L-谷氨酸(L-glutamic acid,L-Glu)90.0g/L。该体系在40℃、pH 4.5和搅拌速度100r/min的最适转化条件下进行反应72h,转化液GABA产量达到了(87.16±4.33)g/L,细胞平均生产力为(48.42±2.41)mg/(h.g),摩尔转化率为(97.60±4.71)%。     

重组大肠杆菌产苯丙氨酸解氨酶(PAL)发酵条件研究

本文对重组大肠杆菌产苯丙氨酸解氨酶的发酵条件和补料培养工艺进行了研究。摇瓶培养条件下,重组菌生长和产酶的最适初糖浓度为10g/L,酵母膏的最适添加量为5g/L,培养基最适初始pH值为7.5。采用10L发酵罐对该菌进行指数流加培养,24 h细胞干重达到到82.4 g/L,产酶量达到3477U/L,比摇瓶培养最好结果分别提高了14.2和11.2倍。     

双水相萃取大豆苯丙氨酸研究

采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和十二烷基硫酸钠(SDS)表面活性剂体系形成双水相,研究大豆蛋白水解液中L–苯丙氨酸分配及萃取效果。CTAB/SDS双水相体系萃取L–苯丙氨酸结果表明,当双水相体系CTAB与SDS摩尔比为0.256,提取液初始苯丙氨酸含量为0.02克,Na2SO4浓度为0.23mol/L时,萃取率最高可达96.9%。     

模拟移动床连续分离L-苯丙氨酸的研究

利用模拟移动床结合离子交换法从酶转化液中连续分离L-苯丙氨酸。在模拟移动床分离过程中,L-苯丙氨酸的吸附波稳定在区Ⅲ,吸附损失为零,单位质量树脂对L-苯丙氨酸的吸附量可达到125g/kg树脂,提高了树脂利用率:利用区Ⅰ的解吸尾流解吸杂质,L-天冬氨酸、蛋白等杂质的解吸波稳定在区Ⅱ,先于L-苯丙氨酸脱离模拟移动床分离系统;L-苯丙氨酸在区Ⅰ被集中解吸,解吸液中L-苯丙氨酸的浓度达35g/L。实验结果表明该法的L-苯丙氨酸解吸收率达97．6%,单位质量L-Phe的氨水(0．5mol/L)消耗率仅为38．37L/kg。     

饮料中天冬酰苯丙氨酸甲酯及其代谢物含量的测定方法

目的：建立快速测定饮料中天冬酰苯丙氨酸甲酯及其代谢物(L- 苯丙氨酸)含量的系统分析方法。方法：采用高效液相色谱法,使用ZORBAX SB-C18 色谱柱,以0.1% 三氟乙酸- 乙腈流动相(85:15,V/V)作为分离条件,在DAD 检测器210nm 波长处进行检测。结果：该方法的最低检出量分别为L- 苯丙氨酸0.8ng,天冬酰苯丙氨酸甲酯2.4ng,标准曲线线性良好,相关系数分别为0.9998 和0.9994,回收率在96.3%～98.5% 之间,相对标准偏差小于2%。结论：该法简捷、快速且灵敏度高。     

胭脂虫甲壳素的提取工艺研究

本实验对胭脂虫(Dactylopius coccus Costa)色素加工剩余物进行甲壳素提取。结果表明,蛋白质脱除最适条件为NaOH 浓度1.0mol/L,反应温度80℃,时间2h;无机盐脱除最适条件为盐酸浓度1.0mol/L,反应温度50℃,时间60min。     

底物和产物对鲜切山药苯丙氨酸解氨酶活性的影响

本实验以山药为材料提取苯丙氨酸解氨酶(PAL),研究底物和产物对山药PAL活性的影响。结果表明:苯丙氨酸促进PAL活性,PAL最适底物浓度为200mg/L,底物浓度过高或过低对酶活力都不利;反式肉桂酸抑制PAL活性,最强抑制浓度为120mg/L,高于或低于这个浓度抑制作用减弱;阿魏酸抑制PAL活性,最强抑制浓度为40mg/L,之后随浓度增加抑制作用减弱,浓度增加至100mg/L时抑制作用最弱,以后随浓度增加抑制作用又增强。     

稻草秸秆的预处理及发酵乙醇的试验研究

通过不同的化学试剂与"汽爆"组合处理稻草秸秆的试验研究,确定了有效的预处理条件:稻草秸秆与3%氢氧化钠溶液(固液比W/V为1:5)混匀,置0.15 MPa(126～128℃)保温5 min,放气.此预处理能使秸秆中木质素去除75.58%;秸秆酶解糖化率(2%底物,0.2%纤维素酶,pH 4.8,0.2 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液,46℃水解48 h)达82.78%;通过酿酒酵母将秸秆纤维素酶解糖化液发酵转化为乙醇,产乙醇浓度达5.0%(V/V).     

蔗糖异构酶突变菌株的构建及其应用研究

蔗糖异构酶是糖苷水解酶13家族的重要成员,可以异构化蔗糖生成异麦芽酮糖和海藻酮糖,同时水解生成少量的葡萄糖和果糖。通过定点突变法对土壤发散菌来源的蔗糖异构酶基因进行定点突变,在大肠杆菌中实现异源表达,获得3例突变菌株R-M1(Q299E),R-M2(Q299D),R-M3(Q299N)。R-M1转化蔗糖的产物当中,异麦芽酮糖的比例从90.28%升至93.16%,海藻酮糖比例从3.09%降低到1.79%。对突变菌株R-M1游离细胞转化蔗糖底物的条件进行了优化,确定了最适转化条件为:30℃条件下,投入浓度为8×109cfu/m L的细胞到蔗糖浓度为50%的10 m L的磷酸柠檬酸缓冲液中,反应90 min,可实现蔗糖最大程度的转化,麦芽酮糖产物浓度达到460 mg/m L。     

明绿豆苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及性质初步研究

为了研究明绿豆中苯丙氨酸解氨酶(PAL)的动力学特性,采用35%和65%饱和度的硫酸铵分级沉淀、DE-52阴离子交换层析方法对明绿豆中的PAL进行了分离纯化,并对其基本性质做了初步研究。结果表明,PAL的纯化倍数为6.982 9,蛋白质得率为4.65%,酶得率为32.45%。PAL在硼砂-硼酸缓冲溶液中适宜的p H范围为7.6~9.0,最适p H有2个:8.0和8.6。PAL适宜的温度范围为35~45℃,最适反应温度为40℃。得到PAL的2个Km值,分别是:Km1为6.94×10-5mol/L,Km2为1.23×10-4mol/L。本研究结果可为进一步研究和开发明绿豆的PAL提供参考。