海刺参组织蛋白酶L基因的克隆、重组表达及活性鉴定

通过RT-PCR和RACE PCR技术,从海刺参(Stichopus japonicus)肠中克隆得到编码组织蛋白酶L(SjCL)基因,其中全长cDNA 1 287 bp,5′非编码区(UTR)202 bp,3′UTR 87 bp,开放阅读框(ORF)999 bp,编码332个氨基酸(aa),包括组织蛋白酶L成熟肽316 aa和信号肽16 aa,分子质量预测为35.3 ku。用SjCL序列与相似物种海胆、海葵等进行对比,可知SjCL具有组织蛋白酶L所特有的氨基酸保守区域ERFNIN和GNFD,以及由Cys 139,His 278和Asn 299残基组成的保守活性位点。将编码SjCL基因克隆进原核表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-SjCL,转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞,再进行诱导表达、亲和纯化和透析复性,得到了纯化且具有活性的重组SjCL。酶活力检测结果表明,重组SjCL对组织蛋白酶L特异性底物Z-Phe-Arg-Nmec具有较高活性,而对组织蛋白酶B特异性底物Z-Arg-Arg-Nmec无活性。本实验对SjCL的cDNA序列进行了生物信息学分析并通过基因工程...     

真菌产人参皂苷葡萄糖苷酶基因的调取

根据已知的人参皂苷糖苷酶(GluGF)的N端氨基酸序列设计简并引物,从Absidia Sp.R84g菌株的总RNA出发,应用RACE技术,快速扩增测序得到cDNA3′末端与cDNA5′末端的未知序列,利用扩增测序所得到的cDNA5′末端和cDNA3′末端的序列设计引物,进行二次RT-PCR扩增并测序得到GluGF基因的全序列。回收PCR产物测序,得到GluGF基因的序列全长为2149 bp,其中5′UTR长度为82 bp,3′UTR长度为114 bp,GluGF的CDS区序列全长为1 923 bp,所编码的氨基酸序列的长度为640个氨基酸。     

重组仿刺参超氧化物歧化酶在大肠杆菌中表达条件的优化及分离纯化

利用基因工程菌BL21(DE3)/pET30a(+)-SOD1,优化表达重组仿刺参超氧化物歧化酶蛋白(rAj-SOD1)。采用摇瓶发酵优化rAj-SOD1可溶性表达的条件,提高蛋白的表达产量。结果表明,在温度30℃、转速200 r/min、0.1 mmol/L IPTG诱导8 h条件下,菌体中rAj-SOD1蛋白表达量最大,达到315.59 mg/L。电泳检测结果表明,rAj-SOD1的纯度为96.7%,符合后续酶活要求。纯化后rAj-SOD1质量浓度为98.73 mg/L,收率为31.28%。邻苯三酚法对rAj-SOD1蛋白进行活性分析,结果表明,纯化的rAj-SOD1蛋白具有明显的抗氧化活性。     

假单胞菌产弹性蛋白酶基因的克隆与表达

从假单胞菌(Pseudomonas sp.)XZG36中克隆弹性蛋白酶基因,构建原核表达载体,实现其在大肠杆菌(Escherichia coli)中的高效表达,并对表达产物进行酶学性质分析,为微生物发酵生产弹性蛋白酶奠定基础.以假单胞菌基因组DNA为模板,PCR扩增弹性蛋白酶基因,并将其开放阅读框(ORF)克隆至融合表达载体pET30a(+)进一步IPTG诱导表达;表达产物经His·Bind亲和层析纯化后对弹性蛋白酶进行酶学性质分析.实验成功克隆了弹性蛋白酶基因,DNA基因片段为1672bp、编码497个氨基酸残基的多肽,与预计长度相符合;实现了其在E.coli中的高效表达,表达量约占菌体总蛋白的20%;经SDS-PAGE分析,相对分子质量为48 000,与预期的一致;提纯后的表达蛋白SDS-PAGE分析可见单一条带,纯度可达92%以上.表达蛋白具有良好活性.     

哈茨木霉丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆表达

为深入研究丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的功能,从哈茨木霉cDNA文库中克隆丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2A)基因,并成功构建到原核表达载体pET28a,在大肠杆菌中表达.表达产物经SDS-PAGE电泳分析,在40.5kDa处出现特异性条带.在22℃以0.5mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白大部分以可溶形式存在,在37℃以1.0mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白则大部分以包涵体存在.全长cDNA序列为1286bp,5′非编码区91bp、3′非编码区237bp,编码327个氨基酸,没有信号肽.本研究为PP2A基因的功能验证奠定基础,以便进一步研究蛋白磷酸酶的功能,从而获得更多关于哈茨木霉蛋白磷酸酶作用机制的信息.     

海参铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及活性鉴定

采用原核宿主大肠杆菌BL21(DE3)成功表达了具有活性的仿刺参铜锌超氧化物歧化酶(Apostichopus japonicus Cu/Zn-superoxide dismutase,Aj-SOD1)蛋白。利用Trizol法从海参肠组织中提取总RNA,通过反转录PCR扩增获得Aj-SOD1基因的编码序列(GenBank:JX097096.1,459bp),构建克隆载体pMD18-Aj-SOD1;在目的基因两端引入(XhoⅠ/NdeⅠ)酶切位点,构建克隆载体pMD18-AjSOD1(XhoⅠ/NdeⅠ)。将此载体与表达质粒pET30a(+)分别双酶切后连接,构建重组表达载体pET30a-Aj-SOD1。转化至大肠杆菌BL21(DE3),Kan+抗性筛选阳性转化子,获得基因工程菌BL21(DE3)-pET30a-Aj-SOD1。SDS-PAGE和邻苯三酚自氧化法检测发现,经0.1 mmol/L IPTG诱导8h后,成功获得具有抗氧化活性的Aj-SOD1蛋白。     

仿刺参过氧化氢酶的克隆、表达及纯化

采用RT-PCR技术从仿刺参肠道组织中克隆了过氧化氢酶(Aj-CAT)蛋白的编码序列(CDS)。通过PCR扩增,成功构建了含有Aj-CAT编码序列的重组表达载体pET28c-Aj-CAT。通过热激法获得用于外源表达仿刺参过氧化氢酶蛋白的基因工程菌株BL21(DE3)/pET28c-Aj-CAT。IPTG诱导后,SDS-PAGE检测发现,基因工程菌能够在体外成功地表达融溶状态的仿刺参过氧化氢酶蛋白。利用镍离子亲和层析柱分离纯化,经200 mmol/L咪唑洗脱后,成功得到纯度为97.6%、能够清除过氧化氢的Aj-CAT蛋白。     

组织型纤溶酶原激活剂重组变异体(Reteplase)的克隆表达和分离纯化

从人脑cDNA文库中经PCR扩增得到组织型纤溶酶原激活剂重组变异体(reteplase,简称r PA,中文名称:瑞替普酶)的cDNA,经测序确证,克隆于表达载体pET22b,转化大肠肝菌BL21进行重组表达.表达的r PA占菌体总蛋白的40%,以包涵体形式存在.经过亲和层析和离子交换层析等纯化步骤后,得到纯度高于99%,比活性高于5×105IU/mg的r PA.对纯化的r PA进行了westernblot,N端氨基酸序列、氨基酸组成、质谱分析等测定.动物血栓模型实验表明:r PA具有较好的溶血栓作用.     

拟南芥肌醇- 1-磷酸合酶类蛋白基因的克隆表达

以野生型拟南芥总RNA为模板,逆转录PCR反应获得拟南芥肌醇-1-磷酸合酶类蛋白基因cDNA（AtMIPS1）,开放读码框为1533bp,编码510个氨基酸．与已报道物种MIPS基因氨基酸序列比较分析表明,AtMIPS1与植物MIPS基因的氨基酸同源性和相似性较高达86％-90％与95％-96％,并含有MIPS基因的保守区域“334SYNHLGNNDG”．将该cDNA序列不改变阅读框架克隆到pET28a（＋）原核表达载体上,SDS—PAGE结果表明：在0．12g／LIPTG诱导2h的条件下得到最佳的蛋白表达效果,AtMIPS1的成功表达为其功能研究打下基础．     

家蚕BmLITAF基因的克隆表达及生物信息学分析

在对家蚕蛹cDNA文库进行分析时,发现一条与脂多糖诱导肿瘤坏死因子α的转录激活因子LITAF的保守结构域同源的保守序列。基因序列全长为981 bp,由97 bp的5端非翻译区序列(5 UTR)、390 bp的开放读码框(ORF)和494 bp的3端非翻译区序列(3 UTR)组成。利用生物信息学方法对BmLITAF进行基因结构分析发现,此基因由3个外显子和2个内含子组成,编码129个氨基酸残基;其预测理论分子量为13.9 kDa,预测等电点6.47;在90~100位氨基酸残基区域具有较高的疏水性,具有跨膜结构域;定位细胞内的可能性较大。根据BmLI-TAF的cDNA序列进行PCR扩增获得目的基因,将其克隆到质粒pGEX-4T-3中,测序验证克隆正确。经IPTG诱导,结果发现目的蛋白主要以包涵体的形式存在。     

重组海参溶菌酶基因工程菌的构建及原核表达

根据GenBank中海刺参溶菌酶的cDNA序列(Accession no.EF036468),利用RT-PCR技术扩增出海刺参溶菌酶的基因片段(SL),将其克隆到原核表达载体pET-32a(+),得到重组质粒pET-32a(+)-SL,再转化至E.coil Rosetta(DE3)pLysS。利用IPTG诱导表达,重组蛋白经SDS-PAGE分析,得到一条分子质量约为31ku的特异条带。经过Western blotting分析鉴定,结果显示重组海参溶菌酶成功在大肠杆菌中表达,并且有部分可溶性蛋白,占总菌体蛋白约10%。这些结果为进一步研究海参溶菌酶的作用机理奠定基础。     

家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位

在自建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条新基因序列,GenBank登录号为DY231426.该基因是一个同源性很低的基因,未发现保守结构域,将其命名为Bmbzj.Bmbzj基因全长661bp,由99 bp的5'端非翻译区序列(5'UTR)、486 bp的开放读码框(ORF)和76 bp的3'端非翻译区序列(3'UTR)组成.生物信息学分析结果表明蛋白Bmbzj可能存在跨膜区和信号肽.将该基因插入到载体pGEX-4T-3中,构建了该基因编码的重组质粒pGEX-4T-3-Bmbzj,转化大肠杆菌Rosetta后,IPTG诱导表达了该融合蛋白,并利用亲和层析的方法纯化该重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体.亚细胞定位实验结果表明该蛋白只存在于细胞质中.     

哈茨木霉Cu-ZnSOD的克隆表达及活性鉴定

为研究哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的生物防治机制并获得与生物防治相关基因,通过构建哈茨木霉菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了哈茨木霉超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)基因的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为465 bp,编码154个氨基酸,理论分子量为15.7 ku.将该基因构建到表达载体pET28上,转化到大肠杆菌BL21菌株中,通过诱导表达条件的优化后,经裂解菌体取上清进行酶活鉴定,确定在蛋白水平上得到了表达.蛋白质表达的最佳条件为:IPTG浓度为0.125 mmol/L,OD600为0.600,培养温度37℃,诱导时间为4 h.目的蛋白SOD的粗酶活为26.69 U/mL.该研究结果为进一步研究哈茨木霉的抗逆境胁迫分子生物学机制奠定基础.     

绿色木霉内切葡聚糖酶基因Ⅰ的克隆表达

为深入研究绿色木霉(Trichoderma viride)内切葡聚糖酶(EGⅠ)的特性与功能,利用Northern blot方法分析不同碳源条件下绿色木霉的egⅠ表达,采用RT-PCR方法从绿色木霉T4中克隆egⅠ基因的cD-NA序列,测序与生物信息学分析,并构建诱导型表达载体pYES2-egⅠ,转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1和H158中表达.结果表明:绿色木霉在含有纤维素的液体培养基中生长,egⅠ高效表达,在秸秆中表达量最高.纤维二糖中表达量相对较低,在葡萄糖、果糖中没有表达.egⅠ基因编码框长度1 377bp,编码459个氨基酸.含有信号肽,为分泌蛋白,属于糖苷水解酶家族7,具有纤维素酶结合域(CBD)和催化域(CD).INVSc1转化子发酵培养48 h达到转录高峰期,60 h达到酶活高峰期,酶活为0.081 6 U/mL,酶活比H158转化子提高32.5%.     

真菌产人参皂苷葡萄糖苷酶基因的调取

根据已知的人参皂苷糖苷酶(GluGF)的N端氨基酸序列设计简并引物,从Absidia Sp.R84g菌株的总RNA出发,应用RACE技术,快速扩增测序得到cDNA3′末端与cDNA5′末端的未知序列,利用扩增测序所得到的cDNA5′末端和cDNA3′末端的序列设计引物,进行二次RT-PCR扩增并测序得到GluGF基因的...     

人参皂苷葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及包涵体的变复性

将人参皂苷葡萄糖苷酶的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。对该基因进行诱导表达,并对包涵体进行变性和复性。结果显示,经终浓度为0.5mmol/L IPTG在30℃下诱导表达4h,进行SDS-PAGE分析,目的蛋白主要以包涵体形式存在并确定其分子质量约为75ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。包涵体经过变性和稀释复性后,经TLC活性检测,能够水解底物Rb1,表明具有人参皂苷葡萄糖苷酶的活性。     

重组海参溶菌酶的表达及其性质

研究了重组海参(Stichopus japonicus)溶菌酶(SjLys)可溶性表达的发酵条件。采用多因素正交优选法,以摇瓶培养方式从培养基组分、发酵条件两个方面对重组海参溶菌酶进行研究,构建了高效分泌型表达重组海参溶菌酶工程菌。研究结果发现,30℃、140r/min、IPTG浓度0.3mmol/L、诱导后继续培养14h,目的蛋白分泌表达量可达到30~40mg/L,且产物以大量可溶性蛋白存在。     

哈茨木霉几丁质酶基因的cDNA克隆及表达

为了研究全新几丁质酶基因Chit37(DQ647957)的特性与功能,将该基因在大肠杆菌中进行了外源表达.通过构建哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了基因Chit37的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为1032bp,编码343个氨基酸,理论分子量为36.6kDa.采用PCR扩增的方法克隆该基因并将其构建到原核表达载体pET28(a+)上,构建了原核表达载体pET-Chit37并转化宿主菌BL21(DE3),菌落PCR及酶切鉴定均证实转化子的正确性,重组蛋白经IPTG诱导后获得表达.优化的表达条件为终浓度0.1mM IPTG诱导培养4h.     

HPV16 E6基因在大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达HPV16 E6重组蛋白.利用自行构建的重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6,经IPTG诱导表达HPV16 E6重组蛋白.实验结果表明,重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6在大肠杆菌中经IPTG诱导成功表达出HPV16 E6重组蛋白.HPV16E6重组蛋白的制备为宫颈组织中HPV16型感染的早期诊断和宫颈癌治疗性疫苗的研制奠定了物质基础.