重组人源化抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体酸性电荷异构体质量评价

目的比较抗人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)单克隆抗体酸性电荷异构体、原液及纯化工艺中阳离子交换层析预洗脱杂质质量差异,为细胞培养工艺研究和纯化工艺参数的调整提供参考。方法采用体积排阻色谱法(size exclusion chromatography,SEC)检测供试品单体、聚体和残体含量;非还原/还原毛细管电泳-十二烷基磺酸钠(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate,CE-SDS)法检测供试品电泳纯度;弱阳离子交换色谱法(weak cation exchange chromatography,CEX)检测供试品电荷异构体分布;毛细管等电聚焦(capillary iso-electric focusing,c IEF)法测定供试品等电点;细胞增殖抑制法测定供试品生物学活性。结果 SEC检测结果显示,预洗脱杂质、酸性异构体和原液的单体含量分别为54.44%、99.08%和99.80%,残体含量分别为44.33%、0.61%和0。非还原CE-SDS结果显示,预洗脱杂质、酸性异构体和原液的主峰含量分别为53.93%、90.83%和95.83%,小分子杂质含量分别为46.07%、9.17%和4.17%;还原CE-SDS结果显示,预洗脱杂质、酸性异构体和原液的轻、重链百分含量分别为78.00%、96.80%和98.85%。CEX检测结果显示,预洗脱杂质、酸性异构体和原液的主峰含量分别为2.60%、16.77%和66.46%,酸性峰含量分别为97.40%、82.53%和25.92%。c IEF检测结果显示,预洗脱杂质、酸性异构体和原液的主峰含量分别为3.21%、18.17%和33.20%,酸性峰含量分别为94.21%、80.18%和64.38%,p I范围分别为6.40~8.85、7.69~8.69和7.94~8.69。生物活性测定结果显示,预洗脱杂质、酸性异构体和原液的比活性分别为0.45×10~4、1.02×10~4和0.94×10~(4 )U/mg。结论 HER2单克隆抗体酸性组分大部分由于单克隆抗体片段化造成;酸性电荷异构体的存在对HER2单克隆抗体的活性影响并不显著。     

抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体CHO工程细胞株的构建、筛选及表达

目的构建抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)人源化单克隆抗体CHO工程细胞株,并进行筛选及表达。方法将抗HER2抗体重链基因Fd及轻链基因VL分别克隆至同一质粒p RH上,将构建正确的重组表达质粒命名为p HER2。通过脂质体法将p HER2转染至二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型CHO细胞(CHO-DG44)中,筛选稳定表达的工程细胞株,进行ELISA及SDS-PAGE检测。同时对抗HER2抗体高表达细胞株进行batch模拟试验。结果从近10 000株克隆中筛选获得3株备选细胞株,命名为H6、H7和H9。细胞株培养上清表达的抗体仅能与重组HER2发生特异性结合;SDS-PAGE检测结果表明,于相对分子质量50 000和25 000处可见重链和轻链的目的蛋白条带。H6、H7和H9细胞株在简单的batch悬浮培养条件下周期约为1周,抗体水平随培养时间的延长而逐渐升高,H9细胞株表达水平最高,为0.52 mg/ml。结论本研究筛选获得的工程细胞株H9具有较高的抗HER2单克隆抗体水平,为靶向治疗HER2过表达的乳腺癌和胃癌等恶性肿瘤奠定了基础。     

人表皮生长因子受体HER2胞外近膜区基因的克隆及原核表达

目的克隆人表皮生长因子受体HER2胞外近膜区基因,原核表达并纯化重组蛋白。方法从人乳腺癌细胞系SK-Br3中扩增HER2胞外近膜区编码基因,克隆并测序后,插入原核表达质粒pET41d中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行纯化。结果从SK-Br3细胞系中扩增出387bp的人HER2胞外近膜区基因;重组表达质粒pET41d/HER2构建正确;IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高;纯化后重组蛋白浓度为1.5mg/ml。结论已成功表达了HER2胞外近膜区蛋白,为抗HER2单克隆抗体的制备提供了抗原。     

疏水性电荷诱导色谱分离抗HER2单克隆抗体

采用疏水性电荷诱导色谱（HCIC）新型生物分离方法,从CHO细胞培养液中高效分离抗HER2单克隆抗体（单抗）。选用典型HCIC介质MEP HyperCel,考察了细胞培养液中单抗稳定性,比较了不同pH下MEP HyperCel介质对抗HER2单抗的吸附性能,发现pH6～9范围内吸附容量均较高,酸性条件下吸附容量显著下降。进一步考察了抗HER2单抗的动态吸附载量,优化了上样和洗脱条件,确定了合适的分离条件,实现了细胞培养液中高效分离单抗,纯度达到94.6%,收率约0.1 mg·（ml料液）^-1。结果表明,HCIC从哺乳动物细胞培养液中分离单抗是切实可行的,为单抗分离提供了新思路。     

重组人源化抗程序性死亡受体-1单克隆抗体关键质控方法的建立

目的建立重组人源化抗程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)单克隆抗体关键质量指标的质控方法。方法经胰蛋白酶切后采用反相高效液相色谱(reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)肽图法对3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体进行鉴别,同时采用还原/非还原型十二烷基磺酸钠毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate,CE-SDS)法、分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法、毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing,cIEF)法、阳离子交换高效液相色谱(cation exchange high performance liquid chromatography,CEX-HPLC)法及混合淋巴细胞反应与竞争ELISA相结合的方法分别检测3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体的纯度、单体和聚体含量、等电点、不同电荷异构体的含量及生物学活性。结果 3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体(批号为batch1、batch2、batch3)的肽图图谱与参考品一致;还原型CE-SDS的纯度分别为97.8%、98.1%和97.9%,非还原型CE-SDS纯度分别为95.7%、95.4%和95.5%;单体含量分别为99.3%、99.1%和99.4%,聚体含量为0.5%、0.6%和0.4%;主峰等电点均为7.4;酸性区含量分别为21.8%、21.4%和21.6%,主峰含量分别为58.4%、58.6%和58.7%,碱性区含量分别为19.8%、20.0%和19.7%;相对生物学活性分别为112%、98%和102%。结论本实验建立的重组人源化抗PD-1单克隆抗体关键质量指标的质控方法可用于该制品的常规质量控制。     

乳癌组织中人类表皮生长因子受体2蛋白的纯化及鉴定

目的建立乳腺癌组织中人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)蛋白的纯化方法。方法采用新鲜的乳腺癌组织制备匀浆液,经60%饱和硫酸铵盐析沉淀法进行乳腺癌组织蛋白的粗提;再通过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和两次Sephacryl S-200分子筛层析进一步纯化HER2蛋白;纯化蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果纯化后HER2蛋白相对分子质量为185 000;HER2蛋白可与兔抗人HER2多克隆抗体发生特异性结合。结论建立的纯化方法获得了具有免疫学活性的HER2蛋白,为HER2单克隆抗体的制备奠定了基础。     

低温甲醇工艺洗预洗甲醇增加过滤器技术方案研究

低温甲醇洗净化工艺是对粗煤气中的 HS₂、CO₂、杂质气体组分进行脱除,其工作原理为以低温甲醇有机溶剂为吸收剂,利用 CO₂、H₂S、COS 比 H₂、CO 在吸收剂中溶解度大的特性而除去,吸收后溶液的再生依靠简单的闪蒸解吸和气体放出 CO₂、H₂S 等。甲醇吸收酸性气体属物理吸收,气液平衡关系开始时符合亨利定律(P=KX),吸收剂的吸收容量随酸性组分分压的提高而增加,溶液循环量与原料气量及操作条件有关。采用低温甲醇洗工艺对粗煤气中的 HS₂、CO₂、COS 进行脱除,但受限于预洗甲醇含有大量的杂质,带入热再生塔后,这些杂质在热在生塔累积,导致热在生塔再生效果下降。本文通过研究低温甲醇工艺洗预洗甲醇增加过滤器技术方案研究,解决低温甲醇洗工艺在运行过程中甲醇排放量大能耗高的问题。     

运用DOE法优化表达抗人类表皮生长因子受体2单克隆抗体细胞用培养基

目的运用实验设计(design of experiments,DOE)方法优化表达抗人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)单克隆抗体细胞用培养基,以提高抗体表达量。方法利用Minitab软件进行DOE,考察不同基础培养基、补料培养基对工程细胞株(CHO-DG44)的细胞密度和抗HER2单克隆抗体表达的影响。结果经过DOE方法优化,在最优培养基组合中工程细胞株的最高活细胞密度(peak viable cell density,PVCD)达296×105个/ml,抗体表达量最高达2.07 g/L,比DOE优化之前最高试验组表达量(1.20 g/L)提高了72%,所表达抗体的质量与原研对照品非常一致。结论得到1组较优的基础培养基与补料培养基配比与组合,该培养基组合提高了细胞密度与抗体表达量,且其适合抗HER2单克隆抗体生产使用,表明DOE是一种短期快速提高抗体表达行之有效的方法。     

重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺的优化

目的优化重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺。方法采用试验设计(Design of Experiment,DOE)方法优化重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺,试验因子为中间清洗液Na Cl浓度(130~870 mmol/L)和洗脱液p H(3.50~4.20),试验响应变量为纯化后样品收率、纯度、残余宿主蛋白含量、外源DNA含量及蛋白A含量,通过DOE构建模型,预测中间清洗液Na Cl浓度和洗脱液p H范围。同时采用DOE方法验证预测工艺参数的稳定性。结果确定中间清洗液Na Cl浓度为400~700 mmol/L,洗脱液p H为3.55~3.75。试验因子在该参数范围内变动时,样品收率均大于80%,纯度均大于97%,外源DNA浓度均低于260 pg/mg,宿主蛋白含量均低于2 300 ng/mg,蛋白A含量均低于6.5 ng/mg。结论成功优化了重组抗CD52单克隆抗体的亲和纯化工艺,且具有较好的稳定性。     

钢铁表面四种预镀工艺比较

从工艺配方和工艺条件、结合力、电流密度范围、分散能力、沉积速率、深镀能力、孔隙率和阴极电流效率比较了预镀镍、无氰碱性预镀铜、酸性预镀铜、氰化预镀铜四种钢铁表面的预镀工艺的性能特点。     

抗EGFR单克隆抗体稳定性的影响因素研究

探讨了影响单克隆抗体稳定性的物理和化学因素。蛋白质浓度影响抗体稳定性,蛋白质浓度增加到一定值时,聚集体和降解片段含量都会增加,样品中高含量的聚集体会进一步促进抗体聚集。制剂p H影响抗体的稳定性,组氨酸缓冲液更有利于保持抗EGFR单克隆抗体制剂稳定性。制剂中聚山梨醇酯20可有效抑制聚集。结果表明:抗EGFR单克隆抗体稳定性的影响因素有蛋白质浓度、样品纯度、环境温度、缓冲液类型、溶液离子强度、溶液p H、表面活性剂。     

抗EGF单克隆抗体表面电荷不均一性的分析

优化了离子交换色谱法分析抗表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)单克隆抗体表面电荷不均一性的条件,分析糖基化对单克隆抗体表面电荷不均一性分布的影响。应用凝胶等电聚焦电泳方法测定单克隆抗体电荷不均一性组分等电点分布范围,再优化离子交换色谱法分析抗EGF单克隆抗体表面电荷不均一的条件,包括色谱柱、流动相pH、梯度及柱温,选择最佳的分析条件分析糖基化对单克隆抗体的电荷不均一性分布的影响。凝胶等电聚焦电泳方法分析抗EGF单克隆抗体电荷不均一性组分等电点分布范围在8.0～8.6范围内,离子交换色谱法分析表面电荷不均一性的最佳条件:TSK-gel CM-STAT离子交换色谱柱、流动相pH 6.0、合适的起始梯度及梯度陡度有利于电荷不均一性各组分的分离,柱温为40℃;去除糖基化的单克隆抗体分布在酸性区的表面电荷不均一组分相对含量增加。合适的分析条件能够使单克隆抗体表面电荷不均一性各组分在离子交换色谱柱上得到最佳分离及获得较高灵敏度,单克隆抗体的糖基化修饰使表面电荷不均一性向碱性区发生偏移。     

两种毛细管电泳方法分析重组人促红素异构体含量的比较

目的全柱成像毛细管等电聚焦电泳(whole column imaging detection-capillary isoelectric focusing electrophoresis,WCID-CIEF)及毛细管区带电泳法(capillary zone electrophoresis,CZE)检测分析重组人促红素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)异构体含量。方法 5批rhEPO原液同时经WCID-CIEF法(采用4 mol/L尿素,0. 35%甲基纤维素,4%两性电解质混合溶液作为样品缓冲液,聚焦电压为3 k V,预聚焦时间1 min,聚焦时间7 min,成像波长280 nm)及CZE法(采用0. 01 mol/L NaCl、tricine、NaAC和7 mol/L Urea及2. 5 mmol/L腐胺混合溶液作为电泳缓冲液,pH 5. 55,进样压力3. 45 kPa,进样时间10 s,分离电压15. 4 kV,分离时间80 min,检测波长214 nm)检测分析异构体含量。结果 WCID-CIEF及CZE法测定5批rhEPO原液均有5～8条异构体条带,异构体含量差异无统计学意义(P 0. 05),具有明显的相关性(r为0. 999),各峰面积占比相差总和小于3%。结论虽然WCIDCIEF谱图及CZE谱图的含义略有不同,但两种毛细管电泳方法的分析结果基本相同,均可满足rhEPO异构体的质量控质需求。     

锌合金压铸件的古铜色处理

1　前　言我们在锌合金压铸件如镜框、工艺品、刀剑柄鞘等进行仿红古铜、青古铜处理时,采用了以下工艺,得到了满意的效果。利用枪黑色镀液,省去了专门配制着黑色溶液的麻烦,黑色光亮Sn-Ni合金镀液光亮区较大,能适用于形状复杂制品的电镀,避免了着色前的下挂具和上挂具,不增加镀种,便于生产管理。2　工艺流程(省略了水洗工序)2.1　红古铜色流程除油→3%HF活化→氰化物预镀铜→5%H2SO4洗→光亮酸性镀铜→枪黑色电镀→钝化→烘干(50～60℃)→拉丝→罩清漆→烘干。2.2　青古铜色流程除油→3%HF活化→氰化物预镀黄铜→5%H2SO4洗→光亮酸性镀…     

锌合金压铸件几个关键电镀工艺的选择

1　引言锌合金压铸件自上个世纪 2 0年代初到现在 ,其加工工艺和电镀工艺也经历了产生、发展和提高三个阶段 ,使用愈来愈广。由于锌合金电位较负 ,内部疏松多孔 ,抗蚀能力差 ,故其表面前处理、电镀都有一些特殊的工艺要求 ,这些工艺如何恰到好处地进行选择就显得尤为重要。2　工艺流程有机物预浸超声波脱脂电解脱脂脱膜活化浸氰预镀氰化铜预镀黄铜光亮酸性铜 (以后从略 )3　主要工艺及技术要求3.1　有机物预浸一般使用汽油或三氯乙烯浸泡 ,都有良好的预脱脂作用 ,但使用中存在不安全因素 ,成本较高 ,大多数厂家不会选用。理想的方法是用商品…     

加氢催化剂膨胀床器外预硫化工艺研究

采用膨胀床对加氢催化剂进行了器外预硫化研究。研究了预硫化工艺条件对加氢催化剂硫化度α的影响。结果表明,α随着硫化温度的增加而增加,但是,烯烃加氢活性在370 ℃时出现最大值。吡啶-TPD表征结果证明,硫化温度高,催化剂的酸性强,而酸性影响催化剂加氢活性。对膨胀床和器内CS₂硫化两种方法预硫化的催化剂进行烯烃加氢活性对比,发现膨胀床器外预硫化催化剂α值高、加氢活性好。器外预硫化的适宜工艺条件:硫化时间10 t₀,硫化温度370 ℃,床层膨胀率12％。硫化和还原同时进行的催化剂活性高。     

NHD和低温甲醇洗酸性气脱除工艺的比较和选择

简述了低温甲醇洗工艺技术和NHD工艺技术,并将两种工艺进行了技术经济比较,以安徽淮化集团公司30万t/a合成氨项目为实例,重点探讨了低温甲醇洗工艺的先进性和流程配置的灵活性,介绍了低温甲醇洗工艺中塔板数的确定、酸性气中H2S浓度的控制、冷量消耗的控制等方法,结合整个合成氨装置能量利用及消耗的优化,对低温甲醇洗工艺进行了经济性评价。     

仿不锈钢色的化学镀镍层研究

1　前言不锈钢以华贵、庄重典雅色泽在装饰、装璜等行业广泛应用 ,化学镀镍以硬度高、耐磨性好、抗蚀性优良在表面处理领域中越来越显示出其重要作用 ,用本工艺可得到均匀一致、光亮度好和色泽逼真的不锈钢色的镀层。2　实验2 .1　工艺流程碱性除油除锈电化学除油活化酸性化学镀镍碱性化学镀镍烘干2 .2　影响镀层色泽的因素影响镀层色泽因素有多种 ,其主要因素是酸性镀液组成及工艺、碱性镀液及工艺、酸性施镀时间及碱性施镀时间、绝对时间和相对时间比。2 .3　工艺条件的确定( 1 )酸性和碱性镀液组成及工艺条件的确定以次磷酸钠为还原剂的…     

玻璃保温瓶胆化学镀镍机理及工艺研究

探讨了玻璃保温瓶胆化学镀镍基本原理和施镀工艺,并概述了碱性除油、化学粗化、敏化、活化、还原等预镀工艺及酸性次磷酸钠化学镀镍浴配方、工艺条件和配液原则.     

重组人源化抗CD52单克隆抗体相对抗原结合活性检测方法的建立及验证

目的建立重组人源化抗CD52单克隆抗体相对抗原结合活性的检测方法,并进行验证。方法测定3种人淋巴瘤细胞(MC/CAR、HUT78、RAMOS)CD52抗原的表达率,选择CD52表达率最高的作为靶细胞。以系列稀释的重组人源化抗CD52单克隆抗体的参比品和供试品作用表达CD52抗原的人淋巴瘤细胞,FITC标记的兔抗人Ig G结合人淋巴瘤细胞上的重组人源化抗CD52单克隆抗体,流式细胞分析仪测定几何荧光均数。通过四参数方程拟合,计算参比品和供试品的半数有效浓度(EC50)及相对结合活性。并对该方法的专属性、准确性、精密性、线性范围和耐用性进行验证。结果淋巴瘤MC/CAR细胞CD52抗原表达率最高,确定该细胞为靶细胞。CD52抗原与无关抗体不存在特异性结合;重复3次测定不同理论相对结合活性人源化抗CD52单克隆抗体参比品的回收率在97.4%~111.9%之间,相对结合活性及回收率的RSD值均在10%以内;同一实验人员于同一天6次重复检测重组人源化抗CD52单克隆抗体相对结合活性在86.93%~114.42%之间,RSD值在10%以内,3 d内不同实验员分别检测5个效价样品的相对结合活性的RSD在20%以内;在重组人源化抗CD52单克隆抗体理论效价50%~150%范围内,与相对结合活性呈良好的线性,线性回归方程为y=1.045 2 x-1.082,R2为0.992 1;MC/CAR细胞在第28代时仍适用于抗CD52抗体相对结合活性的测定。结论该方法具有良好的特异性、准确性、精密性、线性和耐用性,且操作简便,可用于重组抗CD52抗体抗原结合活性的常规检测。