黑曲霉耐酸性α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质

采用耐酸性黑曲霉(Aspergillus niger L.)发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过聚乙二醇6000-KH2PO4双水相萃取、Sephadex G-100凝胶过滤,获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化倍数为36.4,总酶活力回收率达到70%。凝胶过滤表明:该酶表观分子质量为125kD,SDS-PAGE显示其分子质量为58.5kD。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.0,最适温度为65℃,表观Km值为0.915mmol/L,表观kcat/Km值为1.07×105L/(mol.s);水解蜜二糖的表观Km、kcat/Km值分别是21.0mmol/L、9.96×103L/(mol.s);对棉子糖只有微弱的水解作用。水解活性受多种金属离子的普遍抑制,其中Fe3+、Fe2+、Mn2+、Hg+等强烈抑制酶活力。该酶活力在pH1.5～8.2保持稳定,在60℃时保温60min,剩余酶活力达到了60%,是一种热稳定酸性α-半乳糖苷酶。     

热稳定酸性β - 葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

耐酸性黑曲霉菌株Aspergillus niger L.的菌丝体破碎液依次经过乙醇沉淀、离子交换层析和凝胶过滤等步骤处理,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶,SDS-PAGE显示其分子质量为125.7kD。β-葡萄糖苷酶水解对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷的最适pH值为3.0～4.0,最适温度为70℃,表观米氏常数(Km)值为2.35mmol/L,表观kcat/Km值为2.99×104L/(mol ·s);水解京尼平苷、水杨苷的表观kcat/Km值分别是1.26×104、1.37×104L/(mol ·s);水解活性受Mn2+的显著激活和Fe2+、Zn2+、Cu2+等离子的微弱抑制。该酶活性在pH2.0～8.3保持稳定;酶在65℃时保温60min,残余酶活达到了85%,是一种热稳定酸性β-葡萄糖苷酶。     

Purification and Characterization of Intracellular α-galactosidase from Rhizopus sp. AOI

根霉Rhizopus sp．A01的菌丝体破碎液依次经过三相分离、SephaαexG-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了54．8倍,总酶活回收率达到27．3％,在SDS-PAGE上显示相对分子质量为85．6ku的单-条带,凝胶过滤表明该酶表观相对分子质量为302ku。该酶水解对硝基苯-α—D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4．5,最适温度为55％,表观Kn值为（0．242±0．027）mmol／L,表观Kcat／Km值为4．089×10^5L／（mol·s）;对蜜二糖和棉子糖有弱的水解作用,水解速度依次为138．3μmol／（h·mg）、19．7μmol／（h·mg）。水解活性受Fe^2＋和Fe^2＋的显著激活,但受Mn^2＋、Cu^2＋、Hg^＋和Mg^2＋等离子的强烈抑制。该酶活性在pH4．0～8．2保持稳定,在50℃时保温90min,残余酶活达到了48％。     

草菇中木糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

草菇(Volvariellavolvacea)在20L发酵罐中以稻草粉为基质进行培养,所产生的β 木糖苷酶(β 1,4 xylosidase,EC3.2.1.37)经硫酸铵沉淀、苯基 琼脂糖(Phenyl agarose)疏水性柱层析、DEAE Sephacel阴离子柱层析、TOSOHASS HW 5S分子筛过滤分离等提纯步骤,达到了电泳纯,提纯倍数为241倍,收率为14.5%.该酶反应的最适pH值为6.41～6.76,最适温度为55℃;在pH值5.78～7.68之间酶活力相对稳定,52℃的半衰期(t1/2)为1h.由凝胶过滤和SDS PAGE测得酶由4个亚基组成,酶的相对分子质量为2825000.在所测定的底物中,β 木糖苷酶仅对对硝基苯基 β D 木糖苷有专一性水解作用,其对对硝基苯基 β D 木糖苷水解的动力学参数Km值为2.4mmol/L,vmax为42μmol/(min·mg).该酶催化对硝基苯基 β 木糖苷水解将产物β 木糖反转成α 木糖.     

一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的纯化及酶学性质

利用乙醇分级沉淀(37.5%～60%)、SephadexG75凝胶过滤、Phenylsepharose6FF疏水色谱三步分离使一种枯草芽孢杆菌氨肽酶得到纯化,比活1.5567×106U/mg;SDSPAGE鉴定为纯酶,分子质量75ku,全酶含2个亚基。纯酶最适温度60℃,温度稳定范围20～70℃。最适pH8.5,pH稳定范围8.0～10.0。Zn2+、Ni2+有较大的抑制作用,Co2+则对酶活有较强的激活作用。酶活性中心可能结合了2个Zn2+,米氏常数Km为1μmol/L,最大反应速度Vmax为5000μmol/(L·min)。     

硝基还原假单胞菌谷氨酰胺酶的分离纯化及酶学性质

采用离子交换层析和凝胶过滤层析等方法,分离纯化硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)SK16.004所产的谷氨酰胺酶,并进一步研究该酶的酶学性质及反应动力学参数。结果表明,该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为9.0,温度稳定范围为37～60℃,pH稳定范围为5.0～11.0;Cu2+对促进酶活提高作用最大,而Fe3+会抑制该酶的转移活力。谷氨酰胺酶对底物谷氨酰胺的亲和力最强,其Km值为0.72 mmol/L,Vmax为0.55μmol/(min.mL)。     

黏质沙雷氏菌胞外几丁质酶的纯化及特性

黏质沙雷氏菌几丁质酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE-琼脂糖凝胶阴离子交换层析和苯基-琼脂糖凝胶疏水层析,得到电泳纯的几丁质酶和几丁质结合蛋白CBP21。该几丁质酶和CBP21分子质量分别约为58 ku和21 ku,CBP21对该几丁质酶水解几丁质增效明显。几丁质酶反应最适温度为50℃,最适pH约为6.5～7.0。该酶在55℃以下、pH 4.5～8.0范围内稳定。酶的Km值为0.22 mg/mL,Vm为1.26μmol/(min.mg)。金属离子K+、Sn2+、Mn2+对酶有一定激活作用,而Pb2+、Hg2+和Cu2+则强烈抑制其活性。该几丁质酶的糖基含量约为3.3%。EDTA和2-ME可分别提高酶活力65%和105%。H2O2强烈抑制酶活力,提示其活性中心可能存在硫氢基。     

坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶的纯化以及酶学性质

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-50凝胶过滤、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析对坎皮纳斯类芽孢杆菌（Paenibacillus campinasensis）xy-7发酵液进行分离纯化,获得纯化的木聚糖酶,纯化倍数为26.36,酶活回收率为5.13%。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果为单一条带,分子质量为24.5 ku。酶学性质研究结果表明,该酶的最适反应温度为60 ℃,最适pH值为8.0。K+、Fe2+对酶有激活作用,Zn2+、Cu2+对酶有强烈的抑制作用。以榉木木聚糖为底物时,米氏常数Km=4.733 mg/mL,最大酶反应速率Vm=315.85 μmol/（min·mg）。     

宇佐美曲霉木聚糖酶的纯化及其性质

宇佐美曲霉E001固态发酵成熟曲经水浸提、硫酸铵盐析、Phenyl-SepharoseCL-4B疏水层析、SephadexG-75凝胶过滤层析、DEAESepharosefastflow阴离子交换层析等提纯步骤,获得了比酶活3047IU/mg蛋白的纯木聚糖酶,其SDS-PAGE呈单一条带。用SDS-PAGE和凝胶过滤测得木聚糖酶的相对分子质量分别为23.2kD和23.0kD,表明该酶蛋白为单亚基。纯木聚糖酶的最适作用温度和pH值分别为50℃和4.6;以燕麦木聚糖为底物的酶动力学常数Km和Vmax值分别为5.27mg/ml和6494μmol/(min·mg);Ca2+、EDTA对酶有激活作用,而Sn2+、Pb2+、Fe3+有强烈的抑制作用。     

胞外单宁酶纯化及酶学性质的研究

采用黑曲霉B0201固态生料发酵生产胞外单宁酶,经过硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素层析、葡聚糖G-150凝胶柱层析纯化,得到电泳纯的单宁酶,纯化倍数达到18.44。对该酶的性质研究表明:单宁酶的相对分子质量大小约为58800,该酶的最适反应温度是40℃,最适反应pH值是5.0;以PG为底物,米氏常数Km为1.08mmol/L,Vmax为104.1μmol/(L.min)。     

青霉菌柚苷酶的分离纯化及酶学性质

对来源于Penicillium sp.1523的柚苷酶分离纯化工艺进行了系统分析,依次采用超滤、硫酸铵盐析和Sephadex G-200凝胶过滤层析操作对柚苷酶进行逐级纯化,通过SDS-PAGE电泳对各步骤的纯化结果进行分析鉴定,并考察了温度、pH及不同金属离子对酶活性的影响。结果显示纯化后的柚苷酶比活力达到4478.76U/mg,纯化倍数为11.99倍,活力回收率为38.10%。纯化后的柚苷酶经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定显示两条清晰的条带,说明该酶由两个亚基组成,其分子量分别为89ku和72ku;同时酶学性质研究发现最适温度为50℃,热稳定性不理想,最适pH为4.0,Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、EDTA、Cu2+对该酶酶活有促进作用,而Fe2+、SDS在低浓度时便对柚苷酶酶活表现出抑制作用。本研究为青霉菌柚苷酶的大规模生物转化及分子改性提供了实验基础。     

酒用酸性脲酶的纯化及其N端序列的测定

采用乙醇分级沉淀、Superdex200凝胶过滤、Mono Q离子交换对Enterobactria sp R-SYB082产酒用酸性脲酶进行了纯化.SDS-PAGE电泳结果表明,该酶已达到电泳纯,纯化倍数为21.1,酶活回收42%.Superdex200凝胶过滤测定其全酶相对分子质量约为430 000,SDS-PAGE电泳测定其亚基相对分子质量约为72 000,表明该酶为同源六聚体,并利用Edman降解法测定了蛋白质N端序列的8个氨基酸残基序列:S-F-K-M-D-R-K-Q.酶反应的最适pH为4.5,最适温度为35℃.以尿素为底物时,该酶表现Km及Vmax分别为19.5μmol/L和0.87μmol/min.Na 、Mn2 对酶活有一定的激活作用,Ca2 、Zn2 对酶活有一定的抑制作用,酒石酸、琥珀酸对酶活有一定的激活作用,草酸、乙酸对酶活有一定的抑制作用.     

粗糙脉孢菌木聚糖酶酶学性质的研究

对粗糙脉孢菌木聚糖酶粗酶的酶学性质进行了研究,结果表明:该木聚糖酶的最适反应温度50℃、pH值为5.8,温度低于50%、pH 4.6～7.4时该酶稳定性较好;金属离子Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+对该酶的活性有促进作用,K+、Na+、Pb2+、Cu2+、Fe3+、Al3+对酶的活性有抑制作用;EDTA、SDS、DMSO对该酶活性的抑制作用较小;以木聚糖为底物的酶动力学常数Km和Vmax值分别为1.30g/L和1.35μmol/(min·mL).     

Geobacillus sp.GXS1α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以地芽孢杆菌Geobacillussp.GXS1基因组DNA为模板,PCR扩增获得α-淀粉酶基因,构建重组质粒pSE-amy,转化大肠杆菌诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示,有相对分子质量为58ku的特异性蛋白得到表达。用金属镍亲和层析将重组蛋白进行分离纯化,并进行酶学性质研究。结果表明:重组酶的最适温度为65℃,最适pH7.0,Km值为2.93mg/mL,比活力为353.95U/mg,Tm为75℃。金属离子Cu2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、Co2+、Hg2+、Ag+及金属鏊合剂EDTA对酶活有显著抑制作用,Mn2+、Ba2+对酶活有微弱的抑制作用,K+、Ca2+、Mg2+、巯基乙醇对酶有微弱的激活作用,而其它一些离子如Na+、Li+对酶活影响不大。经HPLC分析表明,重组α-淀粉酶催化淀粉的水解产物为葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的混合物。     

低温β-半乳糖苷酶分离纯化及酶学性质研究

对来自新疆天山冻土的Rahnella sp.R3所产的胞内低温β-半乳糖苷酶进行纯化,并对其酶学性质进行研究。采用硫酸铵分级沉淀、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析、Q Sepharose High Performance阴离子交换层析、Sephacryl S-200High Resolution凝胶过滤层析,得到电泳纯酶。酶的活性回收率为21.3%,纯化倍数为35.6,比酶活由1.28U/mg提高到45.54U/mg。SDS-PAGE电泳显示其表观分子量为57.3kDa。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为45℃,在15℃时的酶活为最高酶活的40%,4℃时的酶活为最高酶活的23%。该酶对热敏感,45℃保温45min酶活全部丧失。纯酶的最适pH为7.0,在pH 6.5~7.5时保持稳定。5 mmol/L Na+、Ca2+、Cu2+、Al 3+、Zn2+对酶活力有不同程度的抑制作用,其中Al 3+抑制作用最强,Na+、Ca2+抑制作用不明显。5 mmol/L Mg2+、K+对酶活力具有促进作用,其中Mg2+促进作用较强,使酶活提高到1.19倍。25℃以ONPG为底物的Vmax,Km值分别为7.19mol/(min·mL)、4.64mmol/L。     

绿豆酸性磷酸酶的分离纯化和部分性质研究

从绿豆芽中提取酸性磷酸酶粗酶液。经分段盐析,DEAE-琼脂糖柱离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤后,得到经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一蛋白区带的酸性磷酸酶。提纯倍数为156.3,酶液比活力为347.0 U/mg。凝胶过滤法测定酶分子质量为34.6 ku,SDS-PAGE测定酶的亚基分子质量为33.1ku。证明绿豆酸性磷酸酶为单亚基酶。该酶最适pH为5.2 ku,最适温度为40℃。以pNPP作底物时Km为4.28×10-3mol/L。Mg2+、Co2+对酶有激活作用,而Hg2+,Cu2+,Pb2+和Zn2+对该酶有明显的抑制作用,依次为:Hg2+>Cu2+>Pb2+>Zn2+。K+,Ca2+对酶影响不明显。     

α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,成功异源表达了一株链球菌（Streptococcus）S1的α-半乳糖苷酶基因,重组α-半乳糖苷酶经镍柱纯化后,测定其酶学性质。重组α-半乳糖苷酶最适pH值为6.5,最适温度为50 ℃,在碱性环境中（pH 7.5～10.0）及在40 ℃以下温度条件下该酶较为稳定;酶催化动力学结果显示,该酶在最适条件下水解硝基苯-α-D-半乳糖苷（pNPG）的最大水解速率（Vmax）为508.38 μmol/（min·mg）,米氏常数（Km）值为1.2 mmol/L;通过薄层层析（TLC）法检测到该重组α-半乳糖苷酶可以高效地水解天然底物蜜二糖、棉籽糖和水苏糖中的α-半乳糖苷键。     

露湿漆斑菌胆红素氧化酶的分离纯化及其性质

露湿漆斑菌产生的胆红素氧化酶粗酶液通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 和Sephadex G-100 纯化,得到纯化152.54 倍胆红素氧化酶,得率19.14%;用PAGE 检测为单一条带,活性电泳证实该单一蛋白质组分为胆红素氧化酶, SDS-PAGE 证明该酶的相对分子质量为64 000.该酶最适反应温度为55 ℃,以胆红素为底物时最适pH值为7.5,而以ABTS为底物时最适pH值为4,该酶在pH 3～8之间都能够检测到酶活.以胆红素为底物,胆红素氧化酶的Km值和Vmax分别为552.06 μmol/L和38.91 μmol/(L·min);而以ABTSA为底物,胆红素氧化酶的Km值和Vmax分别为631.84 μmol/L和12.79 μmol/(L·min).     

L68菌株邻苯二酚2,3-双加氧酶纯化及性质

L68菌株中的邻苯二酚 2 ,3 双加氧酶经硫酸铵分级沉淀、DEAE SepharoseFastFlow柱层析、Hydroxyapatite柱层析、Sephadex G15 0凝胶过滤分离 ,并经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 ,达到了电泳纯 .提纯倍数为 2 34 .1倍 ,收率为 2 0 .2 % .酶相对分子质量为 (132± 10 )kDa ,由 4个相对分子质量相同的亚基组成 .最适反应温度 35℃ ,且酶活力在 15～ 65℃比较稳定 ;最适 pH为 8.0 ,在 pH 7.0～ 10 .5酶活力较高且比较稳定 .某些金属离子尤其是Fe3+ 对酶活力有强烈的抑制作用 .以邻苯二酚为底物 ,Km 为 2 0 .63μmol/L ,Vmax为 2 .82 μmol/ (min·mg)     

Bacillus sp.CBB272脱枝酶的酶学性质

脱枝酶是淀粉加工过程中水解其1,6-糖苷键的水解酶,为淀粉彻底糖化所必需。作者从高温菌Bacillus sp.CBB272的培养液中,经过盐析、凝胶过滤层析、弱阴离子交换层析以及强阴离子交换层析联用的方法,纯化出一种新型脱枝酶。该酶在SDS-PAGE上的相对分子质量约为70 000,最适作用温度为70℃,最适作用pH为6.0。该酶在30~70℃、pH 4.5~9.0之间具有优良的稳定性。该酶在50℃和pH 6.0下水解支链淀粉的Km、Vmax分别为4.0324 mg/mL和0.1841 mg/(min.mL)。研究了不同金属离子对该酶活性和热稳定性的影响,发现Ca2+、Mg2+、Mn2+等金属离子对于该酶具有显著的激活效果,并且Ca2+对该酶的热稳定性具有很好的提升作用。