黏土吸附法固定化脂肪酶的初步研究

为研究天然黏土为载体固定化脂肪酶的可行性,采用羟基化、硅烷化处理,对黏土进行改性,并以此为载体吸附固定化脂肪酶,探讨黏土固定化脂肪酶的条件对酶活及蛋白吸附量的影响,优化固定化脂肪酶条件。研究结果表明:黏土经羟基化、硅烷化改性处理后能显著提高固定化酶活和蛋白固定量,其中硅烷化改性最优;载体固定脂肪酶最优条件为:加酶量50 mg/g,载体粒径180—250μm,pH值为4.0,固定化温度25℃,固定化时间2.0 h;与游离酶相比,固定化酶显示出更广的pH值适应性。黏土固定化脂肪酶重复使用10批次后,仍能保留76.85%的初始活力。以天然黏土为载体固定化脂肪酶,具有较好的实际可应用性及操作稳定性,在较低pH值条件下应用具有一定优势。     

明胶膜固定化脲酶的制备及性质

以明胶为载体,戊二醛为交联剂,采用包埋-交联联用法制备了明胶膜固定化脲酶,其酶活力为6 07U/g载体,酶活力收率为66 1%。最优固定化条件是包酶量为10mg酶/g明胶,ρ(明胶)=100g/L,φ(戊二醛)=0 5%。研究了固定化酶的性质,并与游离酶作了比较,游离酶的最适pH=7 0,固定化酶的最适pH=6 5;游离酶的最适温度为60℃,固定化酶的最适温度升至70℃;固定化酶与游离酶的米氏常数Km分别为11 7mM和12 4mM;固定化酶在80℃下180min仍保留初始活力的10%,而游离酶几乎完全失活。固定化酶重复使用20次其活力仅下降15%,4℃下贮存35d后仍保持初始活力的55%。     

以凹土颗粒稳定的乳液为模板制备复合微球固定化酶

以凹土颗粒稳定的Pickering乳液为模板聚合有机/无机复合微球,并以此为载体固定化脂肪酶,当脂肪酶浓度为0.020wt％,固定化温度为45 ℃及pH=7.4的条件下,固定化效果较好,酶活达到最大.脂肪酶固定化后显示出较好的热稳定性、储存稳定性,重复使用三次后酶活仍与游离酶的初始酶活相近.从而为酶的固定化的提供了一条新的途径.     

大孔载体固定化脂肪酶

用自制大孔载体固定化脂肪酶,对固定化条件进行了优化,比较了固定化酶与游离酶的酶学参数. 结果表明,酶粉与载体质量比为1:1、固定化温度在20~25℃之间、固定化时间1.5 h的条件下,所得固定化酶的酶活最高. 固定化酶的最适pH为8.5,最适温度为40℃,其热稳定性、操作稳定性都比游离酶高,4℃下保存7 d后,酶活仍剩余94%.     

溶胶-凝胶法固定化Candida sp.99-125脂肪酶

利用正硅酸甲酯(TMOS)和丙基三甲氧基硅烷(PTMS)为复合硅源,以PEG(MW=20000)为稳定剂,以HCl为催化剂,经过溶胶-凝胶过程包埋假丝酵母99-125脂肪酶. 研究得到最适的固定化条件为：PTMS与TMOS的摩尔比4: 1, R值(水与硅源的摩尔比)20, 给酶量(酶占硅源的质量百分数)3.71%, PEG与酶的质量比(1~1.5):1, 硅源水解时间35 min. 在该条件下,固定化脂肪酶的最高酯化活力是游离酶最高酯化活力的2.02倍. 固定化脂肪酶在100℃保温2 h后酶活仍维持为59.1%,固定化酶催化特定酯化反应,经过8批连续反应96 h后酶活维持不变.     

磁性壳聚糖微球的制备及其用于甲酸脱氢酶的固定化

分别采用乳化交联法和共沉淀法制备磁性壳聚糖微球载体,并对形貌结构进行比较,结果表明,采用共沉淀法制备的磁性壳聚糖微球负载Fe3O4的效果好,故将其作为载体固定甲酸脱氢酶。最佳固定化条件:添加酶量9 U.g-1,pH=7.0,固定化时间5 h。游离酶和固定化酶的最适宜反应温度分别为50℃和30℃;游离酶的最适宜pH=7.0,固定化酶的最适宜pH=6.0;将游离酶和固定化酶分别置于60℃恒温水浴放置180 min后,游离酶和固定化酶的相对酶活力分别为0.78%和40.39%;将游离酶和固定化酶置于不同pH的缓冲液中保存1 h后,在强酸(pH=2.0)和强碱(pH=10.0)条件下,固定化酶的相对酶活力分别为11.03%和38.43%,游离酶已全部失活;固定化酶重复使用6次后,相对酶活力为73.53%,表明固定化酶具有较好的热稳定性、酸碱稳定性和操作稳定性。     

大肠杆菌氨基酰化酶工程菌的固定化研究

分别以聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠(SA)及PVA-SA为固定化载体对大肠杆菌氨基酰化酶工程菌进行固定。结果表明,PVA-SA固定化凝胶颗粒具有较好的机械强度和稳定性。确定PVA-SA的最佳包埋条件如下:PVA质量分数为8%、SA质量分数为1%、固定剂为pH值6.7的3%硼酸-1%氯化钙,此条件下制备的固定化细胞的酶回收率为91.46%。固定化细胞于4℃保存7 d、再室温保存14 d后,其酶活力为初始对照的90.76%,而游离细胞只有初始对照的29.69%。     

明胶多孔支架固定化过氧化氢酶

以明胶多孔支架为载体,戊二醛为交联剂成功地制备了固定化过氧化氢酶,并对其固定化酶的性质进行了研究。固定化过氧化氢酶活力回收率可高达51.1%。与游离酶相比较,虽然催化效率有所降低,但是其固定化酶在65℃保存的稳定性有明显提高。固定化酶可重复使用10次后,活力仍保持在初始活力的60%以上,其具有良好的操作稳定性。     

氨基树脂固定化S-腺苷甲硫氨酸合成酶的研究

以氨基树脂为载体对S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶进行固定化,优化了酶的固定化条件并对固定化酶的性质进行了研究。优化的固定化条件为:戊二醛体积分数5%、SAM合成酶添加量20mg·g-1、固定化时间5h。所制备的固定化SAM合成酶的酶活力为476.8U·g-1,酶活力回收率为74.5%。与游离SAM合成酶相比,固定化SAM合成酶的稳定性大幅提高,在50℃孵育5h酶活力仍保留61.2%,而游离SAM合成酶则完全失活;在pH值为6.0~6.5、8.0~9.5的缓冲溶液中,固定化SAM合成酶也更加稳定;固定化SAM合成酶连续催化反应10批次,酶活力保留86.3%;固定化SAM合成酶在4℃储存30d,酶活力保留81.4%。固定化SAM合成酶米氏常数KATPm=0.14mmol·L-1,KLm-Met=0.28mmol·L-1。     

壳聚糖载体柔性固定化木瓜蛋白酶

用酶柔性固定化模型,以壳聚糖为载体,双醛淀粉为柔性链,对木瓜蛋白酶进行柔性固定化. 通过对固定化条件的优化,得出选用壳聚糖、双醛淀粉制得的柔性载体(Chitosan-DAS50)在酶用量为14.4 mg/g(酶/干球)、pH 8的条件下,固定木瓜蛋白酶18 h,所得的固定化酶活力回收率达72%,相当于采用壳聚糖-戊二醛(Chitosan-GA)手臂载体的3倍. 结果表明,酶的柔性固定化模型可以改善传统共价结合法固定化及手臂固定化酶活力回收率不高的缺陷.     

磁性纳米粒子的制备及脂肪酶的固定化

建立了以纳米级磁性粒子为载体固定化脂肪酶的方法,优化了脂肪酶的固定化条件,考察了固定化酶的性质. 制备的磁性载体平均粒径20 nm,具有超顺磁性,分散和再分散效果好. 固定化酶的最适吸附时间为60 min,酶用量:载体量为1:1,固定化酶的酶活达到718 U/g. 结果表明,经纳米磁性粒子固定化后,脂肪酶得到活化,固定化酶比活为游离酶的1.8倍. 同时,固定化脂肪酶的pH稳定性显著提高.     

三维有序大孔硅材料载体固定化脂肪酶研究

以聚苯乙烯胶体晶体为模板制备三维有序大孔硅材料(3DOM-SiO_2),以其作为载体来固定脂肪酶。分别考察了脂肪酶加入量、反应体系pH、固定反应时间对固定化效果的影响。结果表明,3DOM-SiO_2材料固定脂肪酶的最佳酶液加入量为200 mL/g,固定化最适宜pH为7.0,最佳反应时间为5 h。固定化的脂肪酶在催化性能上与游离脂肪酶相比优势明显,最适宜反应温度提高到40℃左右,并且酶活随温度变化率低,热稳定性明显提高;脂肪酶固定化后对pH的敏感度降低,适应范围更宽,催化反应的最适pH为8.0;固定化脂肪酶重复使用8次后,相对酶活保持在62%。由此可见,3DOMSiO_2材料是固定脂肪酶的优良载体,在酶固定化领域应用前景广阔。     

环氧树脂固定化拟南芥腈水解酶NIT的研究

游离酶不易回收,很难重复利用,而固定化酶重复利用度高。利用LX-1000EP(C)环氧树脂作为载体对腈水解酶进行固定化,研究了其最优固定化条件及其稳定性。最佳固定化条件为:固定化温度为20℃,固定化过程中缓冲液为磷酸钾缓冲液,pH8.0,浓度为0.1mol/L,加量为每克载体加10mL的粗酶液。固定化腈水解酶的最高酶活回收率达到98.1%,固定化酶在重复使用6次后,酶活仍能保持在初始酶活的30%以上。     

固定酶法催化合成生物柴油Ⅰ.大孔树脂固定化脂肪酶的制备

研究了用于生物柴油酶催化的大孔树脂固定化脂肪酶的制备过程,考察和优化了脂肪酶固定化方法及条件。结果表明,采用大孔树脂D3520作载体,以载体涂布法固定化脂肪酶的最适固定化条件为:酶用量为酶∶树脂=0.16∶1(质量比),吸附时间1~3 h,pH值范围为9.0~9.4,固定化温度40℃。酶活力可达91.49 U/g,酶活回收率约为54%。     

天然矿物埃洛石为载体固定α-淀粉酶的工艺和性能

以天然纳米材料埃洛石为载体,通过物理吸附法对α-淀粉酶进行固定.利用红外光谱、扫描电镜、透射电镜等对埃洛石的结构和形貌特征进行测试与表征,同时对埃洛石纳米管固定化α-淀粉酶的条件及固定化酶的酶学性能进行了研究,并与游离酶进行了比较.结果表明:这种具有管状结构的埃洛石硅酸盐矿物是理想的酶载体,酶的固定化效率平均达到37.38%;所得的固定化α-淀粉酶4℃下保存15d后,酶活力仍保持90%以上;固定化α-淀粉酶的热稳定性也明显优于游离酶,连续7批次操作后仍保持56.2%的酶活力.     

Eudragit L-100固定β-葡萄糖苷酶的性能研究

以Eudragit L-100(E)为载体,对β-葡萄糖苷酶(CB)进行固定化修饰,考察了各种因素对固定化酶活力收率的影响。并使用红外光谱、圆二色谱及荧光光谱对固定化产物进行表征。结果表明,酶的较佳固定化条件为pH=11.0,w(E)=1%,ρ(CB)=2mg/mL,固定时间60min,沉淀时间30min,固定化温度25℃,固定化酶活力收率为83%。固定化酶溶解度的变化条件为pH5.2时呈可溶性,pH4.5时呈不溶性。固定化酶的热稳定性有了一定的提高,并且固定化酶重复利用5次后仍保留41%的初始酶活力。     

梳状亲水性环氧基载体固定化Pseudomonas stutzeri LC2-8脂肪酶

以氯乙酰化聚苯乙烯微球(PS-acyl-Cl)为引发剂,亲水性丙烯酰胺(AM)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体,CuCl及联吡啶(Bipy)为催化体系,通过原子转移自由基聚合反应(ATRP)制备得到梳状亲水性环氧基柔性载体(PS-acyl-P(AM-co-GMA)),通过改变AM与GMA配比,使载体环氧基含量和亲水性得到控制.用该柔性载体固定Pseudomonas stutzeri LC2-8脂肪酶,优化了固定化条件,并对柔性固定化酶性质进行考察.结果显示,当n(AM)∶n(GMA)=20∶60,固定化时间为24 h,固定化温度为30℃,固定化pH为7.0时,固定化酶活力达到最高,为24.1U·g-1.固定化酶的最适pH为8.0,最适温度为30℃,其热稳定性比游离酶高,重复使用8次,剩余酶活力80％左右.以上表明,以ATRP法合成的载体PS-acyl-P(AM-co-GMA)可成功用于脂肪酶的固定化,有效提高脂肪酶的稳定性和实用性.     

琼脂包埋法固定化α-淀粉酶特性的研究

以琼脂作为载体材料,采用包埋法固定化α-淀粉酶,并对其特性进行了研究.结果表明,该固定化酶最适pH 值为7.5、最适温度为55～ 58℃,具有较好的贮存稳定性和反应稳定性,18 d后该固定化酶的残余活力仍保留原酶活的71.6%左右,重复使用7次,酶活力下降不大,其酶活回收率达到78.8%.     

海藻酸钠-明胶协同固定化S-腺苷甲硫氨酸合成酶的研究

以海藻酸钠和明胶为载体,对S-腺苷甲硫氨酸合成酶进行固定化。再用戊二醛对其进一步交联,增强固定化酶的稳定性。考察了海藻酸钠和明胶质量分数、CaCl2质量分数、酶和载体比例以及交联剂戊二醛体积分数等因素对固定化酶的影响。结果表明,最佳固定化条件为:海藻酸钠质量分数2.0%、明胶质量分数1.0%、CaCl2质量分数4.0%、固定化酶量为2.5 g/L凝胶、戊二醛体积分数0.6%。交联固定化酶热稳定性得到大幅度提高,在50℃下保温5 h仍保留72%的活力,而游离酶则完全失活。交联固定化酶在碱性溶液中的稳定性较高,在pH=8.0～9.0的缓冲液中4℃保温10 h酶活性仍保留87%以上。将交联固定化酶用于S-腺苷甲硫氨酸的合成,连续反应8批次后酶活性仍保留65%。     

纳米晶镁铝水滑石固定化脂肪酶性质研究

以阴离子型层状材料纳米晶镁铝水滑石为载体通过直接吸附对脂肪酶进行固定,考察了各因素对酶固定化的影响,优化了固定化条件.研究表明,脂肪酶的较优固定化条件为载体用量0.32 g/mL(720 U/mL酶液),30～35℃,pH值7.5,负载6～7 h,制得的固定化酶表观酶活达725 U/g.游离酶和固定化酶的水解活化能分别为5.45 kJ/mol和16.31 kJ/mol,游离酶和固定化酶的表观失活活化能分别为20.28 kJ/mol和29.02 kJ/mol,固定化酶较游离酶稳定.