人肥胖基因在大肠杆菌中的表达

肥胖基因编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。本文利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5’端的CCC转变为大肠杆菌常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆原核表达载体pT7-7,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经温度诱导,SDS-PAGE电泳可见分子量约为：16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的45％以上。表达重组蛋白经纯化,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

重组人IL-6/IL-2融合蛋白的高密度发酵和纯化

克隆的IL-6/IL-2融合蛋白编码基因插入pBV220载体,转化BL21(DE3)菌株中表达。发酵过程中,30℃扩增生长6小时,42℃诱导培养4小时,控制溶解氧在30％～50％。发酵液中最终菌体密度(OD600)达29.17(相当于每升发酵液含55克湿菌体),表达的融合蛋白呈包涵体形式。表达蛋白占菌体总蛋白的30％左右。菌体经过超声破碎后反复洗涤包涵体,融合蛋白纯度达到70％,进一步用离子交换层析和凝胶过滤层析纯化使其纯度达95％以上。IL-6/2融合蛋白中的IL-6和IL-2活性分别为1×107和2×105 U/mg。重组人IL-6,/IL-2融合蛋白在大肠杆菌中达到了中试水平的高表达。     

中国明对虾线粒体MnSOD在大肠杆菌中的重组表达、产物纯化及活性测定

采用PCR方法扩增编码中国明对虾线粒体锰超氧化物歧化酶(MnSOD)成熟肽的基因,并克隆到大肠杆菌表达载体pCRR T7/NT TOPOR TA中进行体外重组表达.重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS后,经IPTG诱导表达产生包涵体形式的目的蛋白.对重组蛋白进行 LC-ESI-MS 分析的结果表明,融合蛋白的三个肽段与中国明对虾线粒体MnSOD 相应肽段完全一致.将重组蛋白通过金属螯合柱进行纯化,进而透析、复性,最后获得了活性高达2373U/mg的重组蛋白.中国明对虾线粒体MnSOD的成功表达,为深入研究其在中国明对虾免疫反应和抗氧化胁迫中的作用奠定了基础.     

斑马鱼胸腺苷酸合成酶基因的克隆与表达

用RT-PCR和RACE方法,从斑马鱼胚胎中克隆出胸腺苷酸合成酶(TS)的cDNA全长序列,分析表明,它的编码框序列含有954个核苷酸,编码一个分子量为36kD的318个氨基酸的蛋白序列.将斑马鱼TS的cDNA序列连接到pET-28表达载体上,构建了一个表达载体pET-28/Z-TS,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了IPTG诱导表达,纯化的TS蛋白在28℃表现出比较高的生物活性,与人的TS蛋白的Km值比较接近.     

C端带多聚组氨酸标签的重组小鼠基质细胞衍生因子-1α原核系统的表达及分离纯化

在构建SDF-1原核表达系统的基础上，探索对其活性表达产物分离纯化的技术路线。将从小鼠骨髓组织克隆出的SDF-1a成熟肽基因插入原核表达质粒pET101／D-FOFO，用以转化大肠杆菌B1221Star^TM菌株，经SDS-PAGE进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot检测证实：其表达产物在约11．6kD处有明显条带显示，其大小与预测的重组SDF-1a／His分子量一致。采用Ni^2 -Resin固相亲和层析法对由该系统表达的C端带6Xhis标签的重组SDF-1a／His进行分离纯化，纯度达92％。体外活性检测结果表明：重组小鼠SDF1a／His对T细胞有明显趋化和促生存作用；能有效诱导Jurkat细胞ERK磷酸化。     

真鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的体外重组与纯化研究

将真鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的成熟肽区域克隆到表达载体pQE30中,并转化到大肠杆菌XL-blue中进行表达。转化子经载体和基因特异性引物进行PCR双向筛选,并将筛选到的阳性克隆经质粒纯化后,进行序列测定。序列测定结果显示,该基因结构正确,且准确插入到表达载体启动子的下游,获得了结构和组成正确的重组子。重、组子经IPTG诱导后,以SDS-PAGE电泳鉴定,电泳结果表明,该基因在大肠杆菌XL-blue中实现了表达。通过对诱导条件的调整,在体外获得了高效表达的重组蛋白,高效表达的重组蛋白约占菌体蛋白的25％-30％。不同诱导时间对重组蛋白影响实验显示,随诱导时间的增加,重组蛋白产量逐渐增高,经4h诱导,其表达量可以达到平台期,过长时间的诱导,对表达产量没有影响。重组蛋白经镍金属亲和层析纯化,获得了纯度较高的重组蛋白。采用交换缓冲液的方法,用Sephadex G150,对重组蛋白进行脱盐复性,使重组蛋白得到了进一步纯化。     

路邓葡萄球菌单宁酶基因的克隆、表达、纯化与改造

为提高路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)单宁酶(Sl-tan)的活性,该文利用化学合成方法获得Sltan基因,将该基因连接到重组表达质粒pET43.1-A,再转化到大肠杆菌感受态细胞BL21-DE3中进行表达,通过亲和层析柱纯化,以没食子酸甲酯为底物进行酶活性测定以及酶学性质分析,并基于生物信息学分析,结合定点突变技术对Sl-tan进行人工改造。结果显示,获得的重组单宁酶产量明显增高,最高可达42 mg/L发酵液;酶学性质研究显示该酶在pH 8.0,温度40℃时获得的活性最高(40 U/mg);Ala460突变为Pro460后的Sl-tan活性可提高82.5%。     

八肋游仆虫一种富含谷氨酸的蛋白GARP的表达与纯化

为研究游仆虫中含有三核苷酸重复序列的GARP基因编码的GARP蛋白在细胞中的功能,利用定点突变技术,将GARP基因中的TGA突变为通用半胱氨酸密码子TGT.突变后的GARP基因构建于原核表达载体pRSETc中,得到重组质粒pRSETc-GARP,将pRSETc-GARP质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,带有纯化标签的重组蛋白His6-GARP获得可溶表达,表达产物与抗His抗体在约26 kDa处有很强的交叉反应.His6-GARP蛋白在不同pH条件下通过两次阴离子交换层析和一次凝胶层析三步纯化达到电泳纯.     

人硒蛋白SelK在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建硒蛋白SelK的重组表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP.方法:利用PCR、酶切和连接酶连接等技术将硒蛋白selk连接到质粒pGEX-6P-1上,通过酶切、序列测定进行鉴定.通过IPTG诱导重组载体在BL21大肠杆菌中表达,并筛选最适诱导剂浓度和最适诱导时间.结果:成功在大肠杆菌中高效表达带有GST的SelK-GFP融合蛋白,占菌体总蛋白的15%,主要以包涵体形式表达.结论:成功构建了pGEX-6P-1-SelK-GFP重组表达质粒,为进一步研究硒蛋白SelK的功能、抗体制各打下了基础.     

星突江鲽胰岛素样生长因子I的体外重组表达及生物活性分析

为了在蛋白水平认识星突江鲽(Platichthys stellatus)胰岛素样生长因子I(IGF-I)的生长调控作用及机制,采用RT-PCR方法扩增了其成熟肽片段,利用原核表达载体p ET-28a成功构建了重组星突江鲽IGFI/p ET-28a质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导获得了N端含6个组氨酸的重组星突江鲽IGFI蛋白。获得的重组IGF-I蛋白大小为12.1 k D,37℃下用0.5 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导3 h时目的蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的39.8%,主要以包涵体形式存在。Western blotting免疫印迹表明星突江鲽IGF-I重组蛋白均可被6×His抗体特异性识别。包涵体经6 mol/L盐酸胍变性、Ni2+离子亲和柱纯化和尿素梯度复性后,可获得高纯度的IGF-I重组蛋白。细胞增殖试验结果显示0.6μg/m L的星突江鲽IGF-I重组蛋白能显著促进人胚胎肾细胞HEK293T的增殖而大于1.8μg/m L时则表现出抑制作用。本研究成功构建了星突江鲽IGF-I体外高效表达系统,并获得具有细胞水平生物活性的星突江鲽IGF-I重组蛋白,结果可为深入探究IGF-I在星突江鲽生长发育中的作用机制及研制高效绿色的促生长制剂提供基础资料。     

铜绿微囊藻生物钟蛋白的表达纯化与抗体制备

为了获得融合表达的铜绿微囊藻(Microcystic aeruginosa)生物钟蛋白KaiA、KaiB、KaiC并制备其相应的多克隆抗体,将kaiA、kaiB、kaiC基因分别克隆到原核表达质粒pET-His中.重组质粒pET-His-KaiA,pET-His-KaiB和pET-His-KaiC经酶切和测序鉴定后,分别转化E.coli BL21(DE3)进行融合表达.经SDS-PAGE分析可知,融合表达的KaiA、KaiB和KaiC蛋白表达量可分别达到菌体总蛋白的25%、40%和20%.经亲和层析后融合蛋白KaiA和KaiB的纯度分别达95%和92%,而KaiC经胶回收纯化后纯度也可达93%.将纯化后的三种Kai蛋白作为抗原分别免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA检测抗体滴度表明,制备的抗KaiA、抗KaiB和抗KaiC的多克隆抗体效价高,分别可达到1:50000、1:60000和1:100000.Western blotting结果表明:获得的多克隆抗体具有较高的效价,抗体能识别相应的Kai蛋白,具有较高的特异性,能用于铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiA、KaiB和KaiC的表达节律检测.     

HIV-1核心蛋白的表达与纯化

将编码人I型免疫缺陷病毒(HIV1)核心蛋白p24gag的基因序列克隆到原核表达载体pET28(b)中,高效表达了N,C端融合His·Tagp24蛋白,所表达的重组p24蛋白占菌体总蛋白的46%。在变性条件下,使用NiNTA亲和层析法纯化了p24蛋白,纯度为94%。菌体中及纯化、复性后的目的蛋白均能与抗HIV1p24单克隆抗体发生特异性反应。用纯化的p24蛋白免疫小鼠,4周时小鼠血清抗p24抗体效价达1∶400。实验结果表明:大肠杆菌表达的HIV1p24蛋白纯化后可用作HIV1检测试剂的原料。     

枯草芽孢杆菌植酸酶基因在大肠杆菌中的表达及其对酶热稳定性的影响

采用PCR法,获得不含有信号肽序列的来源于枯草芽孢杆菌的植酸酶phyC基因的非融合和融合表达片段,分别构建带有T7lac启动子的大肠杆菌的植酸酶pET30NFphyC和pET30FphyC表达载体,并转入大肠杆菌BL21(DE3)。大肠杆菌分别在30℃和25℃经IPTG诱导后实现了植酸酶的表达,非融合和融合植酸酶的表达量分别约占菌体总蛋白的13％和15％,分子量分别为40．13kDa和43．27kDa。表达产物具有植酸酶的生物学活性,非融合植酸酶和融合植酸酶的最适反应温度分别为50℃和75℃,经90℃处理10min,残留酶活性分别为37℃时的31．9％和75．7％。分析表明,含13个氨基酸残基的融合片段有助于植酸酶的表达和酶热稳定性的提高。     

鲤鱼(Cyprinus Carpio) 促性腺激素基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从鲤鱼脑垂体获得了两种GtH β亚基的cDNA, 克隆在pMD18-T载体.经测序确证后,将这两个基因克隆到原核表达载体pET -32(a)中,转化E.coli表达菌BL21(DE3),以IPTG诱导融合蛋白的高效表达.利用初步纯化后的抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.应用制备的兔抗血清与抽提的鲤鱼脑垂体的总蛋白分别进行Western-blot及ELISA分析,结果显示获得的多抗能特异识别各自的天然蛋白.该结果为纯化天然GtH蛋白提供了有效的检测手段,为进一步制备GtH单克隆抗体奠定了基础.     

利用自剪切融合蛋白在大肠杆菌中表达并纯化兔防御素

将源自兔嗜中性细胞的防御素基因NP-1插入原核表达载体pTYB2,并将重组质粒pTYB2-NP1转入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导使防御素以融合蛋白的形式表达。然后,通过亲和层析利用自剪切融合蛋白分离提纯目的蛋白。蛋白电泳检测到以二聚体形式存在的防御素,但此蛋白没有对大肠杆菌的抑菌活性。同时,对该表达纯化系统的特点和用原核生物大肠杆菌表达真核生物防御素的问题进行了分析和讨论。     

重组植物毒素gelonin的纯化及性质研究

采用pET28a载体系统在E.coli BL21中进行了植物毒素gelonin的原核表达，产物经SP-Sepharose，Superdex 75二步纯化，获得了电泳纯的重组植物毒素gelonin。将重组的gelonin与从植物种子中提取的天然gelonin进行了Western blot，ELISA，无细胞体系中蛋白质合成抑制实验以及超螺旋DNA裂解研究。结果都表明，重组植物毒素gelonin与天然gelonin具有相似的生物活性。     

人VEGF受体II基因3区的克隆、表达研究

用RT PCR法从人胎儿脐静脉内皮细胞中克隆人VEGF受体II基因 3区 ,将其重组到 pAYZ表达载体中 ,构建成人VEGF受体II基因 3区表达载体。将该载体转化大肠杆菌 16C9,获得稳定表达 ,表达产物以可溶性状态存在 ;SDS PAGE和Westernblot分析显示 ,其分子量约为 14kD。以纯化的表达产物免疫Balb/c小鼠 ,眼球采血制备抗血清 ,抗血清效价在 10 3以上 ,并具有抑制VEGF诱导内皮细胞增殖的作用 ,在抑制肿瘤血管新生中具有潜在的应用前景。     

新型基因工程抗CD20抗体片段F（ab′）2的构建、表达和活性测定

从抗CD20Fab′表达载体上利用PCR方法扩增并修饰其重键恒定区CH1C－末端的DNA序列,然后将修饰后的CH1DNA序列重组到原Fab′表达载体中,构建成抗CD20抗体片段F(ab′）2表达载体。将该载体转化缩主大肠杆菌16C9,实现了抗CD20抗体片段F(ab′）在工程菌中的可溶性分泌表达。经分离纯化获得具有与抗原CD20特异结合的F（ab′）2在工程菌中的可溶性分泌表达。经分离纯化获得具有与抗原CD20特异结合的F（ab′）2活性片段。竞争性免疫荧光实验的结果表明：抗CD20F(ab′）2片段具有比Fab′更强的竞争性抑制亲本鼠源性单克隆抗体H147与Daudi细胞表面CD20相结合的能力;用MTT法检测所得到的数据说明：F(ab′）2与Fab′更为有效地抑制在体外培养的Daudi细胞的生长。     

牙鲆抗菌肽hepcidin基因在大肠杆菌中的融合表达

根据从实验室克隆的牙鲆抗菌肽hepcidin基因(GenBank登陆号DQ129693)的序列,设计了特异性引物,PCR扩增其成熟肽片段.重组至融合表达载体pGEX-4T-1中,构建成牙鲆抗菌肽hepcidin基因融合表达载体pGEX-fhep,转化至大肠杆菌BL21(DE3)plyS中,筛选得到的阳性克隆用IPTG进行诱导.SDS-PAGE电泳显示在29kD处有特异性的蛋白条带出现,Western-blotting 检测表明已经成功表达了融合蛋白,表达的融合蛋白最高占总蛋白的21%.纯化得到的GST-fhep用凝血酶切割后,用亲合层析得到牙鲆的抗菌肽hepcidin.抑菌实验结果表明抗菌肽对大肠杆菌(ATCC25922)有一定程度的抑制作用.     

结核分枝杆菌DNA疫苗的免疫原性和保护效率的比较研究

对结核分枝杆菌两种DNA单价疫苗的免疫应答和保护效果进行了评价和比较。将结核分枝杆菌抗原蛋白。MPT70(22kDa)和PstS-3(40kDa)克隆到原核表达载体pET22b中,酶切和测序鉴定正确后转化入E．coli BL21(DE3)PLysS宿主菌株内中,通过诱导表达纯化获得目的蛋白用于DNA疫苗效价鉴定。用真核表达载体pJW4303构建了MPT70,PstS-3(包括信号肽的全基因)两种重组真核质粒(DNA疫苗),进行了酶切鉴定和序列分析,确定含有正确的读码框。用上述DNA疫苗分别肌注免疫小鼠,三免小鼠后21天MPT70和PstS-3抗体均达到为1：12800,三免后21天小鼠的脾脏细胞诱导产生较高水平的MPT70和PstS-3特异性的细胞因子γ-干扰素,浓度分别为16872．82pg／ml和11460．98pg／ml.三次免疫后经静脉强毒攻击,两组DNA疫苗免疫鼠的肺脏和脾脏的载菌数均比阴性对照组少,表明这两种疫苗都能诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答,而且以前者为主。综合各项指标发现,DNA疫苗MPT70要优于PstS-3。