乙脑病毒减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞多次传代后病毒基因稳定性研究

目的 研究乙脑病毒减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞(PHKC)传代后E蛋白基因的稳定性。方法 将乙脑病毒(JEV)减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞上传至20代,分析第1代(JEVPHKCKC P1)、第5代(JEVPH-KCP5)、第10代(JEVPHKC P10)、第15代(JEVPHKC P15)、第20代(JEVPHK P20)的E蛋白基因的核苷酸序列,并与Genbank的乙脑病毒减毒株(D90195)比较。结果 RT-PCR扩增出的乙脑病毒减毒株E蛋白基因片段大小为1 500bp,与Genbank库中乙脑病毒弱毒株SA14-14-2核苷酸、氨基酸序列比较显示,JEVPHKC P1,P5,P10病毒与GenbankD90195 E蛋白核苷酸和氨基酸完全相同,P15,P20与E425位点核苷酸和E142位点的氨基酸有不同,同源性分别为99.93％和99.8％。结论 乙脑病毒减毒株SA14-14-2的遗传学特性稳定,从分子水平证明了乙脑减毒活疫苗的安全性。     

乙型脑炎减毒活疫苗病毒SA14-14-2株经三带喙库蚊胸腔接种后的生物学和分子生物学特性

目的研究乙型脑炎病毒减毒活疫苗SA14-14-2株经三带喙库蚊胸腔接种繁殖后的生物学和分子生物学特性,进一步评价该株病毒的稳定性和安全性。方法将乙型脑炎病毒减毒活疫苗SA14-14-2株胸腔接种的三带喙库蚊研磨,离心收集上清液,接种于BHK21细胞中培养,得到SA14-14-2M1C1病毒液。应用空斑形成单位法测定病毒滴度,再进行小鼠脑内毒力测定和乳鼠脑内回传后毒力返祖试验。提取病毒RNA,RT-PCR扩增E基因片段,测序后与SA14-14-2原株的E基因序列进行比较分析。结果SA14-14-2M1C1病毒液滴度达1.4×107PFU/ml,小鼠脑内毒力测定结果无小鼠发病死亡,乳鼠脑内传代对小鼠的脑内致病力很低,毒力为1.9LgLD50/0.03ml,小于《中国药典》规定的3.0LgLD50,且皮下注射未见小鼠发病死亡。扩增出的E基因片段序列与原株相比较,只有E区1340位一个核苷酸的变化A→G,导致E447位1个氨基酸的改变D(Asp)→G(Gly),此差异位点不是SA14-14-2株发生基因变异的8个位点之一。结论SA14-14-2疫苗株病毒经三带喙库蚊胸腔接种繁殖后,其生物学(弱毒)特性和基因特征(E区8个氨基酸突变)未发生改变,进一步证实了该病毒的稳定性。     

乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在乳鼠脑内连续传代后病毒基因的变化

目的研究乙型脑炎病毒(JEV)减毒株SA14-14-2的编码弱毒力基因变化与病毒毒力关系。方法乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在乳鼠脑内连续传代,检测各代病毒的生物学特性和病毒主要结构蛋白即E蛋白的基因序列,并与基因库中登录的JEV强毒株SA14和弱毒株的相应序列比较。结果JEVSA14-14-2在乳鼠脑内连续传代后,病毒的复制滴度增加,对小鼠的脑内毒力也有所增强,但仍低于其亲代强毒株SA14的水平。JEVSA14-14-2在乳鼠脑内传1代后,病毒E蛋白的基因序列未发生改变;传第2代时,E107位点氨基酸发生了变化;第3代开始,E138位点氨基酸出现了改变。其他个别位点氨基酸也发生变化,但无规律性。乙型脑炎病毒强弱毒株间发生变化的其余7个氨基酸未再发生改变。结论JEVSA14-14-2在乳鼠脑内传代过程中,E蛋白基因E107和E138位氨基酸是决定病毒毒力的关键氨基酸。其他非结构蛋白基因也可能与毒力有关。     

麻疹病毒沪-191株在鸡胚成纤维细胞中连续传代的遗传稳定性

目的研究麻疹病毒沪-191株在鸡胚成纤维细胞中连续传代的遗传稳定性。方法将麻疹病毒沪-191株原始种子批(P25)在鸡胚成纤维细胞上传代2次(P27)作为主种子批,继续传代3次(P30)作为工作种子批,继续传代至33(P33)和35(P35)代。对P25、P27、P30、P33和P35病毒基因组进行基因序列分析,并对所有代次病毒进行滴度测定。结果麻疹病毒沪-191株在鸡胚成纤维细胞中从25代传至35代,其滴度维持在5.0～5.875 lgCCID50/ml之间;P25、P27、P30、P33、P35 5个代次病毒的全基因组序列未发生任何核苷酸和氨基酸改变。结论麻疹病毒沪-191株在鸡胚成纤维细胞连续传代,病毒滴度均一,基因组序列未发生改变,遗传稳定性良好。     

麻疹病毒长-47纯化株(2BS细胞)毒种库的建立

目的建立以人胚肺二倍体细胞(2BS)为基质的麻疹病毒长-47纯化株毒种库。方法将麻疹病毒长-47纯化株毒种(CEC)主代主种子批适应于2BS细胞,传至第4代和第8代,分别作为主种子批及工作种子批,对毒种进行鉴别试验、无菌试验、支原体检查、外源因子检查和病毒滴度检测,并对主种子批毒种进行猴体神经毒力试验和猴体免疫原性检测。将毒种连续传代,观察各代次病毒的收获时间,并测定病毒滴度,分析毒种的传代稳定性;将主种子批和工作种子批分别置于-20和-70℃保存,不同时间取样,检测病毒滴度,分析毒种保存温度稳定性;选取4个代次毒种(D4、D8、D15、D19)提取病毒核酸,扩增H基因序列,分析H基因在传代过程中的遗传稳定性。结果主种子批和工作种子批毒种鉴别试验、无菌试验、支原体及外源因子检查均符合《中国药典》三部(2010版)要求,病毒滴度分别为5.88和6.00 log CCID50/ml,主种子批毒种具有良好的安全性及免疫原性。麻疹病毒长-47纯化株毒种适应于2BS细胞后,收获病毒时间一般在6~7 d,病毒滴度稳定在5.5~6.5 log CCID50/ml之间。主种子批和工作种子批病毒于-20和-70℃保存10个月,病毒滴度无明显变化。D4~D19代病毒无核苷酸发生改变,与麻疹病毒Chang-47(Gen Bank登录号:EF033071)比对结果显示,D4~D19代病毒核苷酸序列21 nt由G→C,属于同义突变,同源性达99.9%。结论建立了麻疹病毒长-47纯化株(2BS)毒种库,并按照《中国药典》三部(2010版)要求进行了全面检定,为制备以人胚肺二倍体细胞为基质的麻疹减毒活疫苗奠定了基础。     

大流行流感疫苗毒种(NIBRG-14)的传代稳定性

目的观察大流行流感疫苗生产用毒种(NIBRG-14,E2代)的传代稳定性,为制定毒种传代限定次数提供依据。方法毒种通过SPF鸡胚传代,检测不同代次毒种的生物学指标,并对传代后的遗传稳定性指标,即关键基因(血凝素和神经氨酸酶)和其他基因进行测序分析。结果毒种经连续传代至E12代,各项生物学指标均保持良好的稳定性,E3～E12代病毒感染性滴度均不低于8.54lgEID50/ml,血凝滴度均不低于1∶256,E3、E4及E12代病毒间的HA基因序列均保持一致,基因中被删除的高致病区域的核苷酸序列保持稳定,NA等基因序列在传代过程中也保持一致。结论大流行流感疫苗生产用毒种(NIBRG-14,E2代)连续传10代(至E12代),其生物学和遗传稳定性良好。     

沪191麻疹病毒疫苗株连续传代的基因稳定性

目的研究沪191麻疹病毒疫苗株(S191)在原代鸡胚成纤维细胞中连续传代的基因稳定性,为评估和控制麻疹疫苗的免疫原性及安全性提供依据。方法取S191的22代冻干主种子批在SPF原代鸡胚成纤维细胞上连续传代获得的23、26(用于生产的疫苗代次)、29、31和33代病毒液,提取病毒RNA,RT-PCR扩增后,进行全序列测定,并对病毒关键的保护性抗原进行核苷酸和氨基酸序列分析。结果与22代全基因比较,核苷酸序列同源性:26代为99.96%,33代为99.92%;氨基酸序列同源性:26代为99.98%,33代为99.89%。26代疫苗病毒仅M蛋白第123位氨基酸由苏氨酸→赖氨酸,33代病毒有5个氨基酸差异。结论 26代S191麻疹疫苗疫苗病毒的基因结构高度稳定,疫苗可保持主种子病毒的免疫原性和安全性。     

BRD-Ⅱ风疹病毒疫苗株的连续传代及其基因稳定性

目的观察上海生物制品研究所有限责任公司BRD-Ⅱ风疹病毒株(S-BRD-Ⅱ株)在MRC-5细胞中连续传代的基因稳定性,并比较该毒株与其他上市风疹毒株E1基因的差异。方法将S-BRD-Ⅱ株病毒在MRC-5细胞中连续传10代,检测每代病毒的培养特性和E1基因序列,第28、29、33和38代病毒的ORF序列及第28、38代病毒的5′-和3′-末端序列,同时测定B-BRD-Ⅱ株(北京天坛)及进口疫苗风疹病毒株(RA 27/3)E1基因,并对各基因的核苷酸及其相应的氨基酸序列进行分析。结果 S-BRD-Ⅱ株病毒在MRC-5细胞上连续传10代,其培养特性、细胞病变(CPE)程度及病毒滴度基本稳定,S-BRD-Ⅱ株病毒E1基因未发生变异,与Gen Bank中登录的BRD-Ⅱ株比较,有一个特异性的沉默突变,与RA 27/3疫苗株病毒比较,有122个核苷酸位点及其相应6个氨基酸发生突变。第28、29、33、38代S-BRD-Ⅱ株病毒的ORFⅠ和ORFⅡ基因区域与Gen Bank登录的BRD-Ⅱ株病毒比较,有5个位点发生变异,且P150非结构蛋白编码区域基因出现大片缺失。第28和38代S-BRD-Ⅱ株病毒的5′-末端与Gen Bank中登录的BRD-Ⅱ株序列的5′-末端一致,而3′-末端有一个氨基酸发生突变。结论 BRD-Ⅱ风疹病毒疫苗株在MRC-5细胞中具有良好的传代稳定性,所有上市风疹病毒株的E1基因氨基酸序列差异不大。     

中国狂犬病毒疫苗株CTN-1-V三个代次的GP基因序列分析

目的分析三个代次CTN-1-V病毒株糖蛋白(GP)基因部分序列,并与代表性街毒株进行比较。方法利用RTPCR反应,从感染了CTN-1-V病毒的小鼠脑内获得GPcDNA的部分片段,并进行序列测定。结果三个代次的CTN-1-V病毒株GPcDNA序列的690个核苷酸与代表性狂犬病毒GP核苷酸相应序列同源性为83.2%～96.8%,氨基酸序列同源性为90.0%～97.4%。CTN1V株三代之间的核苷酸序列几乎相同。结论CTN1V株在传代过程中GP基因结构基本稳定,与中国流行的代表性街毒株的同源性高于aG株和PV株。     

流行性乙型脑炎SA_(14)-14-2弱毒株在狗胎肾细胞传代适应的研究

流行性乙型脑炎SA_(14)-14-2弱毒株经原代狗胎肾细胞连续传递4代以后,其病毒滴度稳定在7.5～8.0 log TCID_(50)/0.2ml。传代后的各代病毒(命名为 SA_(14)-14-2PDK-CD)对三周龄小鼠脑内无毒力、皮下无致病力、弱毒力稳定性和免疫原性等特性与原 SA_(14)-14-2 株相同。以该株病毒和原代狗肾细胞制备的活疫苗,经全面检定完全符合现行《乙型脑炎活疫苗规程》标准。     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3基因的克隆及原核表达

目的克隆并表达乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3编码区的基因片段,为重组蛋白进一步的功能研究奠定基础。方法提取乙脑病毒SA14-14-2株总RNA,用RT-PCR法扩增NS3-1、NS3-2基因片段,克隆入原核表达载体pET15bTAT中,构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta2,IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组原核表达质粒pET15bTAT-NS3-1和pET15bTAT-NS3-2经酶切证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约为27000和20000,主要以包涵体的形式表达。重组蛋白纯化后纯度可达80%以上,并可被小鼠抗乙型脑炎病毒SA14-14-2株血清识别。结论已成功克隆了乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3-1和NS3-2基因,并在大肠杆菌Rosetta2中获得表达。     

乙型脑炎减毒活疫苗(SA_(14-14-2))病毒原液及成品疫苗的稳定性观察

目的观察乙型脑炎(乙脑)减毒活疫苗(SA14-14-2)病毒原液及成品疫苗的稳定性。方法取3批乙脑减毒活疫苗病毒原液,分别于20～25、2～8、-18～-22及-38～-42℃储存,间隔一定时间取样,检测病毒滴度;将2～8、-18～-22及-38～-42℃储存的在观察末期符合规定的病毒原液制备成品疫苗,观察其于2～8℃储存的稳定性。结果3批疫苗病毒原液在20～25℃储存16h、2～8℃储存12d、-18～22℃冻存3个月及-38～-42℃冻存6个月,病毒滴度均符合《中国药典》三部(2005版)的要求;由2～8℃储存12d、-18～-22℃冻存3个月、-38～-42℃冻存6个月的病毒原液所制备的成品疫苗2～8℃储存24个月,病毒滴度下降缓慢,且热稳定性良好,符合《中国药典》三部(2005版)的要求。结论乙脑减毒活疫苗病毒原液的稳定性随温度的变化而变化,温度越低,稳定性越好;所制备的相应成品疫苗,在观察期内稳定性良好。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗生产毒株(SA_(14)-14-2)的稳定性研究

流行性乙型脑炎病毒弱毒株经原代地鼠肾细胞连续传至17代后,毒株蚀斑形态与低代次毒株相似,均为一致的小斑,直径为1mm士,边缘整齐;高代次毒株对成龄小鼠的神经内和神经外毒力未发现增高现象;乳鼠脑内返传一代和返祖试验均未发现高代次较低代次毒力明显升高;不同抗原性的单克隆抗体在与低代和高代次弱毒株的免疫荧光反应中未发现抗原位点变化。     

乙脑风疹联合减毒活疫苗病毒间的相容性

目的研究乙脑风疹联合减毒活疫苗中乙脑病毒和风疹病毒的相容性。方法将乙脑病毒SA14-14-2疫苗株制备的乙脑减毒活疫苗原液与风疹病毒RA27/3疫苗株制备的风疹减毒活疫苗原液按体积比1∶1比例混合,加入保护剂,冻干制成乙脑风疹联合减毒活疫苗。采用BHK21细胞蚀斑法测定联合疫苗中的乙脑病毒滴度,细胞病变法检测风疹病毒滴度;通过鉴别试验、热稳定性试验、乙脑疫苗免疫原性试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验以及基因稳定性分析观察联合疫苗病毒间的相容性。结果联合疫苗的乙脑和风疹病毒滴度与单价疫苗的病毒滴度变化在检测误差的允许范围内;联合疫苗于37℃放置7 d,与放置前相比,风疹病毒和乙脑病毒的滴度值下降分别小于1.0 LgCCID50/ml和1.0 LgPFU/ml,符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗中的风疹疫苗对乙脑疫苗的免疫原性无明显的干扰效应;鉴别试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验结果均符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗在BHK21细胞上传代5次后,乙脑和风疹病毒基因序列均未发生变化。结论乙脑风疹联合减毒活疫苗中的乙脑和风疹病毒具有较好的相容性,本实验为乙脑风疹联合疫苗的进一步研制奠定了基础。     

流行性乙型脑炎14-2株病毒在乳狗肾细胞上的适应性

流行性乙型脑炎14－2株弱病毒在乳狗肾细胞上连续传11代，1代的病毒滴度即达6．21LogPFU／ml，1代后各代病毒滴度无显著升高（6．18～6．40LogPFU／ml）。传代后的病毒对3周龄小鼠脑内无毒力，皮下无致病力，经乳鼠脑内传代后的脑内毒力为1．5～3．0LogLD5／0．03ml，与14－2原株的持世无显著差异。用乳狗肾细胞为基质制备的冻干活疫苗，经全面检定完全符合现行《乙型脑炎活疫苗规程》标准。     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1和E蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达乙型脑炎病毒(JEV)NS1和E蛋白,并初步探讨其免疫原性。方法采用RT-PCR法扩增JEVSA14-14-2株NS1和E蛋白基因片段,分别克隆入原核表达载体pET-30a(+)和pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-30NS1和pET-32Et,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达水平。两种蛋白经亲和层析纯化后,Western blot鉴定其反应原性。通过小鼠主动和被动保护力试验及豚鼠病毒血症试验,检测两种蛋白的免疫原性。结果酶切及测序证明重组表达质粒构建正确;表达的重组NS1和E蛋白的相对分子质量分别约为40000和47000,均以包涵体形式表达;纯化的重组NS1和E蛋白的浓度分别为160.7和380μg/ml,均具有良好的反应原性;小鼠主动和被动保护力试验表明两种蛋白均有保护活性;豚鼠病毒血症试验显示,NS1蛋白免疫豚鼠后能明显抑制病毒血症的产生。结论已成功表达并纯化了JEVSA14-14-2株NS1和E蛋白,两种蛋白均有较好的免疫保护活性。