一株烟草花叶病毒生防细菌的鉴定及代谢物活性研究

从烟田土样中分离到1株对TMV有拮抗作用的细菌By33,通过形态观察、生理生化试验及16SrDNA同源性序列分析,鉴定该菌为解淀粉芽孢杆菌。通过对By33代谢产物对TMV抑制作用测定发现,其代谢物质对温度敏感,80℃处理30min,丧失大部分活性,遇酸沉淀,碱性条件下稳定,对蛋白酶不敏感。     

抗马铃薯Y病毒(PVY)和烟草花叶病毒(TMV)单联弱毒疫苗的研制及防效测定

为防治烟草马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）,筛选PVY和TMV基因组中保守且高效表达siRNA的片段,连接到烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV）弱毒侵染性克隆,制备成单联弱毒疫苗,获得TVB-PVYF1、TVB-PVYF2、TVB-PVYF3和TVB-TMVF1、TVB-TMVF2、TVB-TMVF3共6个单联弱毒疫苗。室内筛选后选取保护效果最好的TVB-PVYF2和TVB-TMVF3两个单联弱毒疫苗在山东临沂、潍坊和黑龙江哈尔滨等地进行了田间防效测定,TVB-PVYF2对黑龙江哈尔滨、山东临沂和潍坊烟草PVY的相对防效分别为66.88%、76.46%和60.71%,TVB-TMVF3对黑龙江哈尔滨、山东临沂和潍坊烟草TMV的相对防效分别为80.74%、87.34%和74.40%。      

抗烟草花叶病毒(TMV)生防菌的鉴定及其发酵条件优化

为有效防治烟草普通花叶病毒病(TMV),从土壤中分离筛选到1株抗TMV的细菌菌株Z5,经形态学、生理生化和分子生物学鉴定为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis),该菌培养液对TMV体外抑制率达到96.40％,田间小区试验对烟草普通花叶病毒病的防效为50.43％.通过单因素法优化Z5发酵体系,最适培养基...     

生防菌BZ3对烟草普通花叶病毒的生防效果及全基因组分析

利用稀释分离法从烟草根际土壤中分离筛选获得抗烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）的优良生防菌株BZ3,通过形态、生理生化和分子生物学鉴定菌株种类,评价其对TMV的生防效果,利用全基因组测序及生物信息学分析其次生代谢产物合成相关基因簇。结果表明,从根际土壤中分离的BZ3菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）,其发酵液对TMV的盆栽和田间小区防效分别为58.97%和72.07%;基因功能预测显示菌株BZ3基因组中含有表面活性素等多种具有抑菌活性的次生代谢产物合成相关基因簇。本研究表明,BZ3菌株对TMV生防效果优良,抑菌谱较广,基因组中含有大量抑菌活性物质合成相关的基因簇,具有作为TMV生防菌剂的潜力。     

卷烟携带烟草普通花叶病毒(TMV)的测定研究

对国内15个省市34个卷烟厂家64个品牌的卷烟样品生物检测结果表明,TMV检出率为67.69%;不论是混合型还是烤烟型以及不同等级的卷烟样品都可以检出。卷烟烟丝研磨液和不同浓度的TMV汁液一样,接种后足以导致烟苗发病。      

拮抗细菌对烟草花叶病毒(TMV)的抑制作用研究

从发生烟草花叶病毒(TMV)的烟田耕作层土样中分离到对TMV有拮抗作用的菌株By33和By88。生物测定试验表明,By33和By88的无菌发酵液对TMV的体外抑制作用分别为81.81%和83.29%,涂抹菌液24 h后接种TMV,仍有73.01%和66.98%的预防作用。硫酸铵沉淀无菌发酵液、PBS透析获得拮抗蛋白;拮抗蛋白对TMV的体外抑制作用分别为85.38%和87.47%,并且在274.00 nm处有明显的蛋白吸收峰,为典型的蛋白质吸收光谱。此外,通过叶圆片法和透析法生物测定表明,抗病毒蛋白与TMV粒子结合作用为不可逆,有抑制TMV在烟株体内复制的作用。     

渭北烟区烟草蚀纹病毒和黄瓜花叶病毒侵染循环的研究

用酶联免疫吸附实验(ELISA)对渭北烟区6科18种植物461个病毒标样的TEV和CMV检测,对蚜虫种类,主要传毒蚜虫发生规律、蚜虫传毒测定以及烟草蚀纹病毒(TEV)和烟草黄瓜花叶病毒(CMV)的侵染循环进行了调查研究。结果表明,TEV的自然寄主有辣椒、番茄、龙葵、蔓陀罗、酸浆以及刺儿菜和菠菜,刺儿菜是主要越冬寄主;CMV的寄主有辣椒、番茄、豇豆、菜豆以及油菜、萝卜(留种)、菠菜、刺儿菜,其中油菜是主要越冬寄主。越冬后的TEV和CMV通过有翅蚜虫(主要是桃蚜)传给烟草、辣椒、番茄等蔬菜以及杂草,秋季又通过有翅蚜虫传给越冬寄主。      

生防镰刀菌(Fusarium sp.)对烟草列当的防效

为了减轻列当对烟草的危害,利用自主分离纯化并繁殖的生防镰刀菌(Fusarium sp.)进行了烟田列当防治试验.结果表明,烟田土壤先用硫磺调节酸碱度后再穴施生防菌,然后在列当寄生前期分3次向土壤中喷施生防菌的效果最好,可推迟列当出土时间3d,生防菌对列当的寄生率为31.20％,对烟田列当的防治效果达62.44％,同时烟田其他病害发生情况最轻,烟叶产量为4895 kg/hm2,上中等烟比例达89.89％,比对照提高33.95％.     

纳米银对烟草花叶病毒(TMV)的抗性及作用机理

为了开发安全、高效、低毒的新型生物源抗烟草花叶病毒(TMV)药剂,用壳寡糖和壳寡糖席夫碱分别合成了壳寡糖纳米银(cos-Ag)和壳寡糖席夫碱纳米银(简称席夫碱纳米银,S-cos-Ag),并在珊西烟草和普通烟草品种秦烟96上进行了枯斑试验和与抗病性相关指标的测定。结果表明:1S-cos-Ag稀释30倍处理对TMV具有较好的预防和治疗效果,能够显著地减少感染TMV叶片的枯斑数目,预防效果达78.33%;2S-cos-Ag稀释30倍处理能够不同程度地提高烟草叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,同时叶绿素和可溶性蛋白含量也有明显增加,而丙二醛(MDA)含量有所下降。说明S-cos-Ag稀释30倍处理能够较好地诱导烟草对TMV产生抗性,提高烟草免疫力,从而减轻TMV对烟草的侵害。     

烟草灰霉病复合生防细菌的筛选

采用平板对峙法和孢子萌发法,测定470株烟草内生细菌对烟草灰霉病菌的抑菌活性,初筛出抑菌作用较强的27株菌株;利用烟叶组织法进行复筛,获得防治效果超过50%的12株菌株,属于芽孢杆菌属或假单胞菌属;测试了7株生防菌之间的亲和性,除菌株Y98外,其他菌株之间均表现亲和;根据菌株亲和性及生防效果,选择5株生防菌株进行混配,测定其对烟草灰霉病的防治效果,发现芽孢杆菌菌株Y11与假单胞菌菌株Y141在其比例为2:1时的防效较好,且高于单菌株处理。      

两株烟草根际拮抗菌的生防和促生效果研究

使用植物根际促生细菌(PGPR)来防治土传病害是目前生物防治的研究热点。在温室内进行盆栽试验以研究从烟株根际筛选出的两株生防细菌对烟草黑胫病的防治和促生效果,试验设4个处理,分别为接种生防菌YC0573、YC0136、药剂对照(甲霜灵锰锌)和发病对照。结果表明,温室条件下YC0573和YC0136的防治效果分别达到90.9%和95.4%,均高于甲霜灵锰锌(86.4%);接种生防菌的烟株生长状况明显好于对照烟株。对不同生长期烟株叶片叶绿素含量、电解质相对渗透率以及超氧化物歧化酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、过氧化氢酶等系统抗性相关指标进行测定,结果显示,两株拮抗菌可诱导烟株产生系统抗性(ISR),增强对病害的防御力,并且能有效防治烟草黑胫病,促进烟株生长,具有良好的应用潜力。     

沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草

  目的  本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T₁代转基因抗CMV株系。  方法  构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）,以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85。  结果  抗性筛选获得112株T₀代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T₀代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T₀代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株。选取10个T₀代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T₁代抗病性,发现部分T₁代烟株发生一定比例的抗感分离,T₁代抗性株率为46.7%~100%。Real-time PCR检测T₁代烟株,发现T₁代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株。  结论  基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。      

烟草蚀纹病毒(TEV)生物学及理化特性的研究

从自然感病的烟草上分离到烟草蚀纹病毒(TEV)。其寄主范围较宽,经汁液摩擦接种普通烟产生明脉和坏死性蚀纹,在蔓陀萝上为斑驳和畸形,不侵染苋科的千日红及豆科和葫芦科植物。致死温度为53℃,稀释限点为3×10~(-3),体外保毒期为4天。蚜虫传毒试验表明,可经桃蚜进行非持久性传毒。粗提纯的病毒制品在电镜下为稍弯曲的线状粒子,大小约728×12-13nm。病毒粒子经5-40％的蔗糖密度梯度离心后,显示出单一主峰,其紫外吸收值最大为258.5nm,最小为241.7nm,A280/260之比值为1.27。降解病毒所得核酸和蛋白的紫外吸收值分别为最大258nm及273.9nm,最小为233nm及250nm,经PAGE测定其分子量分别为3.16×10~6道尔顿及2.98×10~4道尔顿。用提纯病毒制备所得抗血清效价为1:512;经琼脂双扩散试验证明只与分离的病毒起沉淀反应,而与CMV、TMV、ToRSV、TNV、PVY则无反应。     

烟草疫霉生防细菌的筛选及鉴定

为获得防治烟草黑胫病的生防菌株,通过对峙平板法,从烟田土壤中分离出1株对烟草疫霉具有很好抑菌作用的细菌B40-3.培养3 d后,该菌株对烟草疫霉抑菌带宽度为0.9 cm,抑菌圈半径为2.3 cm,并对其余12种植物病原真菌有很好抑制作用.该菌株在LB液体培养基中,37 ℃,210 rpm条件下培养40 h,OD值达到最大值.依传统生理生化反应鉴定,B40-3属于枯草芽孢杆菌.     

贝莱斯芽孢杆菌F85对烟草炭疽病的生防作用研究

为明确贝莱斯芽孢杆菌对烟草炭疽病的生防作用,通过贝莱斯芽孢杆菌BacillusvelezensisF85和烟草炭疽病菌Colletotrichum fructicola共培养试验,测定了不同浓度的F85无菌发酵滤液（0.5%～20%）对C. fructicola的菌丝生长、分生孢子萌发及附着胞形成的影响,评价了F85对活体叶片的烟草炭疽病的防治效果。结果表明：（1）贝莱斯芽孢杆菌F85对C. fructicola、C. kahawae、C. karstii、C. siamense均表现出较好的拮抗作用,具有广谱抑菌效果。（2）贝莱斯芽孢杆菌F85可有效抑制烟草炭疽菌C. fructicola菌丝的生长,同时抑制炭疽菌分生孢子的萌发和附着孢形成。随F85无菌发酵滤液浓度升高,对C. fructicola的抑制作用更明显。20%F85无菌发酵滤液处理C. fructicola菌丝干质量抑制率和分生孢子芽管畸形率均达100%。（3）5%浓度以上的贝莱斯芽孢杆菌F85无菌发酵滤液对活体烟草炭疽病的防效高于70%。本研究丰富了烟草炭疽病生防菌资源,为开展烟草炭疽病的生物防治提供了理论依据。     

烟草花叶病毒强、弱毒株对烟草植株的影响

分别接种烟草花叶病毒强毒株（TMV-W）、诱变获得的两个弱毒株（TMV-017、TMV-152）于普通烟（品种为K326）。间接ELISA法测定了强，弱毒株在接种叶上的增殖速率，同时考察了叶绿素a、叶绿素b，叶绿素，可溶蛋白含量的变化。实验发现强毒株在接种后第2d就可检测到，而弱毒株在第3d被检测到，弱毒株在烟草植株体内的稳定浓度低于强毒株，分别受强，弱毒株侵染的烟草叶片中的叶绿素a,叶绿素b，叶绿素含量都有所下降，但强毒株引起的下降幅度最大。受强，弱毒株分别侵染的烟叶中可溶性蛋白含量均发生变化，初期都有所升高，之后，弱毒株随着侵染时间的延长而有所下降，而强毒株下降后又有所回升。     

黔南烟草马铃薯Y病毒(PVY)株系的分子鉴定

为了揭示贵州省黔南烟区马铃薯Y病毒(PVY)株系分布及分子变异规律,先利用血清学方法初步鉴定PVY株系,再选择19个PVY分离物进行分子鉴定.结果表明,克隆的19个PVY cDNA片段全长均为1074 nts,包含1个801 nts的完整cp基因,编码266个氨基酸.序列比对发现,19个黔南PVY分离物cp基因核苷酸序列相似性为87.0％ ～ 99.9％,与GenBank登录的其他17个PVY株系cp基因序列相似性为86.6％ ～ 99.9％.系统进化树分析表明,黔南烟区19个PVY分离物中,有3个PVY分离物与PVYN株系和PVYNTN亲缘关系较近,而其他16个PVY分离物与PVYNN:O株系的亲缘关系最近.     

疫霉葡聚糖激发子Gep1诱导烟草对烟草花叶病毒的抗性研究

烟草花叶病毒病是危害烟草的重要病害,可通过激发子诱导烟草产生抗病性。利用乙醇沉淀、DEAE-52、SephadexG-100柱层析的方法,从疫霉菌中分离纯化出一种葡聚糖类激发子Gep1。Gep1诱导后,烟草叶片产生和积累H₂O₂、酚类物质;烟草叶片苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶和过氧化物酶活性均有不同程度的提高。Gep1可以诱导烟草抗TMV。盆栽实验表明,4 mg/mL Gep1的防效为67.4%,降低了发病率,推迟了发病时间。半定量RT-PCR结果显示,Gep1激发子诱导烟草抗病相关基因的上调表达,表明Gep1可激发烟草防卫反应,诱导烟草产生系统抗性,提高烟草对病毒的抗性。     

筛选诱导烟草对烟草花叶病毒产生系统抗性的真菌

真菌产生的代谢产物可激活烟草体内抗病防御相兲酶的表达,诱导烟草产生系统抗性,增强烟草对病毒的抗性。本研究对38种植物病原真菌及45种分离自（恩施、襄樊）土壤、烟叶中的真菌进行了过敏性反应实验和系统抗性实验。结果表明,筛选出了对烟草花叶病毒抗性较强的真菌。在烟草上产生过敏反应的菌株有32个;系统抗性实验中对烟草花叶病毒抑制率较高的菌株有16个,其中,油茶炭疽菌、棉花黄萎病菌、esf-13、esf-3、小麦赤霉、立枯丝核菌、E1、esf-6、xfpf-6等菌株的抗性较高,枯斑抑制率均大于70%,最高可达96.44%。抗性较高的真菌可开发为烟草病毒病诱抗剂。