55株芽孢杆菌16S rRNA基因序列测定与系统发育学分析

采用16S rRNA基因序列分析法对中国工业微生物菌种保藏管理中心(CCIC)保藏的55株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行复核鉴定。菌株经纯化培养,以改良CTAB法提取总DNA,采用细菌16S rRNA通用引物、TD-PCR方法(touchdown-PCR)进行16S rRNA基因序列扩增,PCR产物纯化后直接进行序列测定,序列经人工校对后用Clustal X进行比对分析,最后用MEGA3.1软件构建系统发育树。系统发育分析结果表明:55株枯草芽孢杆菌中有52株菌种与原鉴定结果一致,有3株菌种与原鉴定结果存在差异,其中2株鉴定结果为巨大芽孢杆菌(B.megaterium),另1株鉴定结果为地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)。     

腐败醋中微生物的分离鉴定及乳酸链球菌素对其抑制作用

从腐败醋中分离出84 株不同微生物菌株,通过对其形态学观察、革兰氏染色、16S rDNA测序,并与GenBank中已知序列进行比对,以及进一步测定16S～23S ITS,发现其由20 株解淀粉芽孢杆菌、12 株地衣芽孢杆菌、6 株芽孢杆菌属1NLA3E、12 株蜡样芽孢杆菌、4 株巨大芽孢杆菌、3 株短短芽孢杆菌、2 株短小芽孢杆菌、11 株凝结芽孢杆菌、12 株类芽孢杆菌、1 株耐酸乳酸菌、1 株产气荚膜梭菌组成。除耐酸乳酸菌外,均为革兰氏阳性芽孢杆菌。通过管碟法和比浊法测定了乳酸链球菌素（Nisin）对以上菌株的抑菌效价,显示Nisin对腐败醋中分离得到的微生物菌株均具有明显的抑菌或杀菌活性。     

糙米中蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及其毒力基因与药敏性检测

本文从一份糙米样品中分离纯化出5株细菌,分别命名为BR1、BR2、BR3、BR4和BR5,对其进行形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA及gyrB基因测序鉴定,并对其毒力基因及药物敏感性等生物学特征进行研究。结果表明,5株分离菌株生化特性符合蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的特性,结合16S rRNA及gyrB基因测序结果,菌株BR1和BR4鉴定为蜡样芽孢杆菌。毒力基因的PCR检测结果表明,菌株BR1和BR4携带肠毒素基因（hbl、nhe、entFM和bceT）和细胞毒素K基因（cytK）,未检测到呕吐型毒力基因（cer和ces）。菌株BR1和BR4对青霉素、氨苄西林和头孢噻肟等药物耐药,对阿莫西林中度敏感,对诺氟沙星、环丙沙星和庆大霉素等药物敏感。本研究通过分离鉴定糙米源蜡样芽孢杆菌,发现分离菌株携带多种毒力基因,并且对青霉素类、头孢菌素类及磺胺类等药物耐药,表明糙米中的蜡样芽孢杆菌有引起食源性疾病的风险。     

一株高产蛋白酶芽孢杆菌的鉴定

通过经典生理生化实验和16S rRNA序列分析,对新分离出的1株高产蛋白酶的芽孢杆菌进行系统鉴定.研究发现该菌卵磷脂酶试验和马尿酸盐反应均为阳性,并在60℃仍有蛋白酶活性.将该菌16S rRNA序列在Genbank中进行blast,发现其与枯草芽孢杆菌EHFS1-S02Hc的16S rRNA序列同源性高达99.63%,分离出的高产蛋白酶芽孢杆菌可能为一新亚种或生物型.     

甘蔗糖厂成糖工序生产线样品中部分细菌菌株的鉴定

通过16S rRNA序列分析,结合微生物的形态学观察、生理生化试验对甘蔗糖厂成糖工序生产线检出的部分细菌进行了分离鉴定。结果显示,从甘蔗糖生产线样品中获得常见的4株菌,菌株S-1鉴定为克氏库克菌(Kocuria kristinae)、菌株S-2为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、菌株S-3为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、菌株S-4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。因此,糖厂应该加强微生物污染源和污染途径的监控,以此保证甘蔗糖品质。     

细菌型豆豉发酵菌株的鉴定

为了明确细菌型豆豉发酵菌株的身份,首先采用形态及生理生化方法进行鉴定,接着提取该菌株的基因组DNA,并根据芽孢杆菌属16S rDNA序列两端的保守性片段设计引物,然后用PCR方法扩增出16S rDNA部分序列,纯化、测序,最后经BLAST搜索进行序列比对和构建系统进化树.结果表明,菌株BBDC3为革兰氏阳性芽孢杆菌,生理生化特征与枯草芽孢杆菌相符;扩增出的16S rDNA部分序列长为1344bp,与序列号为EF488171的枯草芽孢杆菌16SrDNA序列的相似度最高,为99%;系统进化树中,菌株BBDC3与枯草芽孢杆菌AB018487在同一分支.因此,菌株BBI)C3属于枯草芽孢杆菌.     

堆积醅中耐高温细菌的分离与鉴定

从江苏双沟酒业股份有限公司堆积醅中筛选得到7株耐高温细菌。形态特征观察、生理生化特性测定结果结合16S rDNA序列同源性分析以及部分基因特异性序列分析,结果表明,7株菌株中3株为地衣芽孢杆菌,3株为枯草芽孢杆菌,1株解淀粉芽孢杆菌。     

低糖腌制韭菜根中优势腐败菌的分离与鉴定

以胀袋变质的低糖腌制韭菜根为材料,对贮藏过程中的主要腐败微生物进行分离筛选与鉴定。利用纯培养法共筛选出菌落形态差别较明显的优势细菌菌株4株,经形态学观察、革兰氏染色、生理生化鉴定及16S rRNA序列分析鉴定确定了各菌株的种属。结果发现,腌韭菜根中的主要致腐菌由1株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、1株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、1株解淀粉芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)和1株莴苣不动杆菌(Acinetobacter lactucae)构成。     

清香型白酒乳酸利用菌的筛选及鉴定

利用透明圈法,从清香型白酒大曲中筛选出两株可以产生透明圈的菌株B4-1和B36-1。通过对两株菌株进行16S rRNA基因测序鉴定,并构建系统发育树,结合生理生化试验结果,最终确定两菌株均为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。单一碳源发酵及葡萄糖-乳酸混合发酵试验结果表明,在葡萄糖存在的情况下菌株B4-1和B36-1的乳酸利用量分别为1.91 g/L和1.26 g/L,符合乳酸利用菌的筛选特征。因此两株菌均可以作为清香型白酒的乳酸利用菌。     

一株转化阿魏酸产香兰素菌株的筛选与鉴定

采用梯度稀释平板分离法从土壤中分离菌种,并通过与研究中心实验室购买和保存的其他11株菌株进行比较,最终筛选出了一株香兰素摩尔转化率和转化效率相对较高的菌株B7,结合菌株形态学特征、生理生化试验结果和菌株16S rRNA序列分析鉴定及系统发育分析结果,最终鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。     

冬季甜瓜腐烂病原菌的分离与鉴定

从冬季贮存甜瓜的腐烂组织中分离病原菌,并对其类型进行检测分析。利用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基和溶菌肉汤(LB)培养基培养,依据微生物形态特性,真菌的26S rRNA 序列和细菌的16S rRNA 序列比对以及系统发育进化分析等分子生物学方法,共分离到22 株菌种,其中真菌13 株：包括青霉2 株、链格孢4 株、白地霉4 株、酵母3 株(梅奇氏酵母2 株、毕赤酵母1 株);细菌9 株：包括沙雷氏菌5 株,丁香菌1 株,克雷伯菌、肠杆菌和芽孢杆菌各1 株。根据26S rRNA D1/D2 区序列比对和系统进化树结果显示,两株酵母菌121 和122 可能是梅奇氏酵母属潜在的新种。青霉和链铬孢是甜瓜腐烂致病菌,白地霉和沙雷氏菌是人体致病菌,表明目前甜瓜贮存方法需要进一步改进和完善。     

黄粉虫内生菌的分离鉴定及其对淀粉、纤维素和木质素的降解活性的测定

目的 分离培养黄粉虫体内细菌, 并测定这些菌对淀粉、纤维素及木质素的降解活性。方法 对黄粉虫表面消毒, 以LB和高氏一号培养基分离虫体内部细菌并进行16S rRNA基因序列分析。变色圈法测定降解活性。结果 共分离到8株细菌, 16S rRNA基因序列分析表明, 1株属于肠球菌属, 3株属于乳酸球菌属, 2株属于芽胞杆菌属, 另2株属肠杆菌属。水解酶测定结果表明, 菌株FJAT-18107具有淀粉和木质素水解作用, 其16S rRNA基因序列与解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens (NR_075005)最相似。结论 本研究为了解昆虫内生菌功能提供了参考。     

宜宾浓香型白酒窖泥中细菌的系统发育多样性

采用纯培养和免培养(culture-independent)分析方法,对宜宾多家规模以上白酒企业成熟窖泥细菌多样性进行了研究。采用改良牛肉膏蛋白胨培养基(NA)和高氏I号分离培养基分离细菌(包括放线菌),并评价菌株的乙醇耐受能力和低pH耐受能力。构建了窖泥样品总DNA的16S rRNA基因克隆文库。分别挑选不同培养特征的89株细菌纯培养物和427个基因克隆的16S rRNA基因序列,进行系统发育分析。89株纯培养物分属于13个属,以Streptomyces(39株)和Bacillus(27株)为优势属。纯培养菌株中,具备7%浓度乙醇耐受能力和低pH(4.5)耐受能力的分别有16株和10株。挑取的克隆子经测序、去除嵌合体后,得到了406个有效序列,并在97%的序列相似性水平上可将其分为75个OTU(Operational Taxonomic Unit),分属于Clostridia、Bacilli、Acti-nobacteria、γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、Deinococci、Planctomycea、Bacteroidia 8个纲。其中Clostridia为绝对优势菌群,包含50个OTU、227个克隆子;Bacilli包含11个OTU、128个克隆子,为次优势菌群。证明宜宾浓香型白酒窖泥中细菌群落存在丰富的系统发育多样性。     

Bacillus cereus group strains, their hemolysin BL activity, and their detection in foods using a 16S RNA and hemolysin BL gene-targeted multiplex polymerase chain reaction system

Hemolysin BL (HBL) is a major virulence factor for Bacillus cereus group strains. It is also a target enterotoxin for the most commonly used B. cereus detection kit, i.e., the B. cereus enterotoxin (diarrheal type) reversed passive latex agglutination (BCET-RPLA) test kit. A survey of the HBL activities and the cytotoxicities to the Chinese hamster ovary (CHO) cells for the B. cereus group strains, however, showed that although only part of the B. cereus group strains are HBL active, all strains show cytotoxicity to the CHO cells. Thus, methods that allow the detection of not only the HBL but also of the B. cereus group strains are important. In this study, by comparison of the gene sequences of the 16S rRNA for B. cereus group and other bacteria strains, we designed primers B16S1 and B16S2 specific to all the B. cereus group strains. In addition, because HBL is a major enterotoxin, we also designed HBL gene-specific polymerase chain reaction (PCR) primers, i.e., Hm1 and Hm2, that generated the same results as those of the hemolysis and BCET-RPLA assays. Primers B16S1/B16S2 and Hm1/Hm2 could be combined into a multiplex PCR system for the simultaneous detection of B. cereus group cells and the possible presence of their HBL enterotoxins. Also, all these PCR systems allowed the detection of n x 10(0) CFU B. cereus cells per g of food sample if an 8-h enrichment step was performed prior to the PCR.     

植物乳杆菌及其近缘种部分看家基因的系统发育分析

本文研究了16S rRNA基因、pheS和pyr G部分基因序列对Lactobacillus plantarum(L.plantarum)及其近缘种的区分能力,采用分离自酸面团、酸牛奶和泡菜中的10株L.plantarum为研究对象,以其看家基因pheS和pyr G部分基因序列作为分子标记,结合已上传至Gene Bank的近缘种的相应序列构建系统发育树并与以16S rRNA基因构建的系统发育树进行比较。结果表明:基于16S rRNA基因序列不能区分L.plantarum及其近缘种,而看家基因pheS和pyr G部分基因序列能够很好的区分植物乳杆菌种及其近缘种,其中,pheS在植物乳杆菌种内分型时相较于pyr G基因效果更好,以及将pheS和pyr G部分基因序列串联使用后,试验菌株与参考菌株的分类关系更加明晰,因此,联合基因(pheS-pyr G)可作为16S rRNA基因的辅助工具用于L.plantarum及近缘种和植物乳杆菌种内分型的快速分类鉴定。