纳豆激酶基因工程菌的构建及酶活力分析

纳豆激酶由纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)的aprN基因编码,在体内外具有很强的溶解纤维蛋白活性。利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增B.subtilis natto的aprN基因,并依据B.subtilis的密码子偏好性优化了起始30个氨基酸的密码子,构建了重组表达质粒pHT01-aprN。经限制性酶酶切、PCR扩增和测序验证了其编码的正确性。通过电击法将含有强启动子的pHT01-aprN导入B.subtilis,利用氯霉素抗性筛选获得B.s 168/pHT01-aprN工程菌。经IPTG诱导表达,摇瓶发酵培养最高酶活力为(289.00±3.42)U/mL,是野生菌的3.9倍,酶活力表达稳定性良好。     

海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为表达平台,海藻糖合酶为表达蛋白,研究了单启动子和多个启动子串联对外源蛋白表达的影响。分别选择6个启动子构建P_(srfA)、P_(43)单启动子和P_(abrB-spoVG-LytR-mmgA)四个时期特异性启动子串联表达系统进行验证。根据实验结果分析,组成型启动子P_(43)转录强度最高,摇瓶中酶活达到3 381 U/g,串联启动子P_(abrB-spoVG-LytR-mmgA)强度次之。针对验证酶活最高的重组菌pHT01-P_(43)-treS进行发酵优化,并在5 L发酵罐中进行放大实验,酶活达到7 215 U/g。实现了海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中自诱导高效表达,为获得高效率制备海藻糖合成酶的表达系统奠定了基础。     

解淀粉芽孢杆菌psd基因过表达对胞苷发酵的影响

以解淀粉芽孢杆菌BG-09(Bacillus amyloliquefaciens BG-09)为出发菌株,分析代谢途径中与细胞膜渗透性有关的基因psd,研究过表达基因psd对胞苷发酵的影响。以解淀粉芽孢杆菌BG-09基因组为模板克隆psd,构建了含psd的重组质粒pHT43-psd,通过化学转化法转入菌株大肠杆菌DH5α,验证成功后将其转入B.amyloliquefaciens BG-09,获得重组菌株B.amyloliquefaciens BG-09-psd。将B.amyloliquefaciens BG-09-psd菌株通过摇瓶发酵,研究过表达基因psd对菌体的生长、胞苷和尿苷产量积累的影响。结果显示,重组菌株B.amyloliquefaciens BG-09-psd发酵液中胞苷浓度为1.199 g/L,与对照菌株B.amyloliquefaciens BG-09相比,提高了15.51%,尿苷浓度为0.552 g/L,增加了6.56%,表明过表达基因psd可促进胞苷的积累。     

动态高压微射流对聚半乳糖醛酸酶的影响

利用动态高压微射流(DHPM)处理聚半乳糖醛酸酶(PG),通过对酶活、圆二色谱、紫外光谱和巯基含量的测定,研究DHPM对PG酶活性和构象的影响.结果显示,经75,125,175 MPa的动态高压微射流处理后,PG酶的相对活性分别为93.2%、95.3%和91.2%;125 MPa分别处理2、3次后,PG酶的相对活性分别为97.4%、88.2%.分子构象分析表明,经不同压力DHPM处理后,PG酶的β-折叠含量有不同程度降低,PG 酶分子结构更为"松散",原来包埋在分子内部的TrP和Tyr残基部分暴露出来,分子表面的二硫键被打断形成巯基,但从分子整体来看,新的二硫键形成的量要多于被打断的量.     

蛋白质谷氨酰胺酶在毕赤酵母中的异源表达

蛋白质谷氨酰胺酶(protein glutaminase, PG)可水解蛋白质侧链的谷氨酰胺残基,生成氨和蛋白质-L-谷氨酸,从而增加负电荷、降低蛋白等电点,进而改善蛋白质的功能特性。但其生产菌株解朊金黄杆菌的产酶量较低,仅有0.258 U/mL,且基因操作效率低,故近年来多采用异源表达的方法,以提高其产量。该实验成功实现蛋白质谷氨酰胺酶酶原(Pro-PG)在毕赤酵母GS115中异源表达,还进行了培养基优化及重组酶学性质的研究。结果表明：重组毕赤酵母pPIC9K-Pro-PG/GS115在摇瓶水平经1%(体积分数)甲醇诱导120 h,表达出的Pro-PG经胰蛋白酶加工后,PG酶活力达到0.878 U/mL。酶学性质研究发现,重组的PG最适作用温度为60℃,在不超过60℃时孵育1 h其相对酶活力可保持在80%以上;该酶作用的最适pH为6.0,在pH 3.0～8.0条件下孵育1 h其相对酶活力可保持在70%以上。     

脱乙酰基酶在枯草芽孢杆菌中的高效可溶性表达

为提高脱乙酰基酶的可溶性表达含量,对前期挖掘的脱乙酰基酶NAP-Das2. 3基因进行异源表达及发酵优化。将脱乙酰基酶NAP-Das2. 3基因克隆至枯草芽孢杆菌表达载体p P43NMK的npr B信号肽下游,转入B.subtilis WB800构建了重组工程菌B. subtilis WB800/p P43NMK/nap-das2. 3,并对重组菌培养及发酵产酶条件进行了优化。重组菌最适培养和产酶条件分别为甘油6 g/L、牛肉膏30 g/L、Na Cl 10 g/L; p H 7. 5、培养温度37℃、装液量100 m L (500 m L摇瓶)、培养30 h。在优化的条件下,发酵液中脱乙酰基酶酶活达到106. 42 U/L,较出发条件提高了424. 68倍,在5 L发酵罐培养30 h后,脱乙酰基酶酶活达到116. 13 U/L。研究实现了脱乙酰基酶的异源高效可溶性表达,为脱乙酰基酶的应用提供了基础。     

冬枣软化衰老过程中细胞壁酶的活性变化

冬枣果实的软化分为两个阶段。前期下降缓慢,后期加快;低温下PG活性在贮期末呈上升趋势。Cx- cellulase活性变化与PG相似:PME在果实快速软化衰老之前出现活性高峰,可能与快速软化衰老的启动有关。     

低温贮藏期间‘长富2’果实细胞壁酶及基因表达的变化

以‘长富2’苹果为实验材料,测定冷藏(1~4℃)期间果实多聚半乳糖醛酸酶(poly galacturonase,PG)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性及基因表达变化,同时分析果实硬度、可溶性固形物(soluble solid content,SSC)、可滴定酸和还原糖含量。结果表明,果实的硬度和可滴定酸持续下降且变化显著;SSC和还原糖含量在贮藏前期有少量增加后缓慢下降;PG活性及Md PG1、Md PG2表达量均增加,PG活性和Md PG2表达量均在120 d达到峰值,Md PG1表达量在60 d达到最大值。β-Gal活性持续增加,与果实硬度呈显著负相关;Md GAL1和Md GAL2表达量在60 d之前增加,60 d以后迅速下降。总体上,PG和β-Gal基因表达先于酶活增加,对两种酶活性变化有重要作用。     

冬枣软化衰老过程中LOX和PG的作用

以不同成熟期冬枣果实为试材,研究了在常温和低温贮藏条件下LOX和PG的活性变化规律.结果表明:常温下果实软化衰老速度加快,低温显著延缓果实的软化衰老速度,但并不能阻止其进程.LOX与PG均参与了果实的软化衰老,LOX的活性高峰出现在硬度速降期之前,与果实快速软化衰老的启动有关;在果实硬度速降期内,PG活性明显上升,表明PG与果实的快速软化衰老密切相关,属于诱导性酶.     

根霉碱性果胶酶的酶学性质研究

采用本实验室分离保藏的根霉菌GZ-11进行液体发酵,生产碱性果胶酶.确定了发酵周期,并研究了该酶的酶学性质,结果表明:PG酶活可达186.7万U/mL,PGL酶活可达21.3U/mL.PG的最适温度是50℃,pH稳定范围是7.0～9.0,最适pH是8.6;PGL的最适温度是45℃,pH稳定范围是8.8～10.6,最适pH是9.4.     

耐高温α-淀粉酶高密度高表达发酵条件的优化

通过摇瓶实验对产耐高温α-淀粉酶的重组菌E.coli BL21的高密度高表达发酵条件进行研究。考察不同培养基和不同发酵条件对该菌株产耐高温α-淀粉酶的影响,并利用正交试验进行优化。结果表明:在葡萄糖0.5g/L,酵母粉15g/L,pH6.5,诱导时机为接种后发酵4h,诱导时间为6h,IPTG添加量为0.8mmol/L,接种量为体积分数3%的优化条件下,该重组菌发酵液菌体生物量为原来的1.29倍,酶活力达到8.754U/mL,是原来的1.55倍,目的蛋白的表达量也为原来的1.24倍。     

响应面法优化产β-内酰胺酶菌Bacillus cereus B03的发酵条件

为快速高效地提高菌株Bacillus cereus B03的产酶能力,采用响应面法对Bacillus cereus B03产β-内酰胺酶的发酵培养基进行优化。首先通过单因素实验研究了不同碳源及浓度、不同氮源及浓度、不同金属离子及浓度、氯化钠、磷酸氢二钾以及温度、pH、接种量、装液量对菌株产酶活力的影响,然后设计Plackett-Burman试验筛选出影响产酶的3个显著性因素:温度、pH、接种量。在此基础上,最后设计Box-Behnken中心组合试验确定最优产酶发酵条件。结果表明,最佳发酵培养基成分为葡萄糖20 g/L、酵母浸粉20 g/L、NaCl 2 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L,K₂HPO₄·3H₂O 4 g/L,最佳产酶发酵条件为发酵温度37 ℃,pH为7.3,接种量3%,装液量50 mL/250 mL。在此优化条件下,该菌株产β-内酰胺酶的酶活力为113278.7 U/mL,为优化之前酶活(88792.7 U/mL)的1.28倍。本研究为进一步工业化开发利用性状稳定且高产β-内酰胺酶的菌株提供借鉴。     

特基拉芽孢杆菌来源β-1,3-1,4-葡聚糖酶重组菌发酵培养基的优化

为了提高重组大肠杆菌(Escherichia coli BL21DE3)(pET-28a(+)-bgl)发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的能力,研究了发酵培养基中各类碳源及氮源的影响,并通过响应面分析法优化培养基各组分的含量。结果表明,甘油为最适碳源,酵母粉及胰蛋白胨为氮源。优化的培养基组成是:yeast extract终浓度为20 g/L,胰蛋白胨12.5 g/L,甘油14.1 mL/L,KH2PO42.17 g/L,K2HPO42.74 g/L。三角瓶发酵产β-葡聚糖酶酶活(2 978.2 U/mL),与初始培养基(1 671.9 U/mL)相比,提高了1.78倍。研究结果表明,发酵培养基的优化对重组大肠杆菌发酵生产工业酶具有重要作用。     

嗜碱性芽孢杆菌产高碱碱性蛋白酶发酵培养基及发酵条件的研究

对一株高产高碱碱性蛋白酶的嗜碱性芽孢杆菌的发酵培养基及发酵工艺进行了优化。确定了发酵培养基所采用的棉籽饼粉最适粒度为 80目 ,麦芽糊精的最佳DE值为 3 0 %。并确定了该菌株的最适发酵培养基配方为 ( g/1 0 0mL) :棉籽饼粉 3 ,酵母浸粉 1 75 ,麦芽糊精 1 0 ,柠檬酸钠 0 3 ,CaCl2 0 3。K2 HPO4 1 ;最适摇瓶发酵条件为 :种龄 1 2h ,接种量 2 %,装液量 5 0mL/2 5 0mL ,摇床转速 2 0 0r/min ,3 4℃ ,发酵 5 4h ,碱性蛋白酶的发酵单位可达 3 3 985u/mL ,比优化前提高了5 4 48%。此外 ,还进行了 5L罐放大实验 ,在 5L罐所确定的最适工艺条件下 ,发酵单位可达3 65 79u/mL。     

重组大肠杆菌产谷氨酰胺转氨酶培养基及发酵条件优化

对已构建好的表达谷氨酰胺转氨酶的大肠杆菌Rosetta DE3的摇瓶培养条件及发酵条件进行优化,所获优化培养基配方为葡萄糖4.0g/L,酵母膏3.0g/L,NH4Cl 4.0g/L,Na2HPO42.0g/L,K2HPO41.0g/L,MgSO4.7H2O 1.0g/L,NaCl 3.0g/L。得菌株发酵培养的最佳优化条件为装液量为25mL,接种量为5%,加IPTG浓度为0.6mmol/L,诱导时间为4h。     

D-阿洛酮糖3-差向异构酶在大肠杆菌内的高效可溶性表达及发酵条件研究

将来源于Clostridium bolteae ATCCBAA-613的DAEase基因序列经密码子优化合成,以pCold TF为表达载体,冷休克启动子CspA低温诱导DAEase基因在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21 （DE3）中表达,得到高效可溶性的重组Cb-DAEase并利用镍柱亲和层析分离纯化。结果表明,Cb-DAEase最适pH和温度为7.0和55 ℃,Co2+能够显著（P<0.05）增强酶活力。对培养条件进行优化得到,在7 g/L甘油、10 g/L酵母膏、1%接种量、0.25 mmol/LIPTG、诱导前培养5 h的条件下,Cb-DAEase活力达到（10.11±0.02）U/g,比优化前(1.38±0.01) U/g提高了7.33倍;以120 g/L的D-果糖为底物全细胞催化0.5 h后,D-阿洛酮糖产量为（11.47±0.04）g/L,比优化前（1.03±0.02）g/L提高了11.14倍。基于冷休克表达策略构建的重组菌经发酵优化后Cb-DAEase活力显著（P<0.05）提高,为高效制备D-阿洛酮糖提供了理论支持。     

特基拉芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶的异源表达及高密度发酵

L-天冬氨酸α-脱羧酶（L-aspartate α-decarboxylase,PanD）能选择性脱去L-天冬氨酸的α-羧基生成β-丙氨酸,具有重要的工业应用价值。以特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）PanD37的基因组为模板,扩增PanD表达基因panD,构建表达质粒pET32a（＋）-panD,转入Escherichia coli BL21（DE3）成功实现异源表达。利用摇床和发酵罐优化培养条件实现高密度发酵,确定最佳培养条件为：37?℃培养8?h,加入终浓度0.5?mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）降温至26?℃诱导,采用葡萄糖为碳源并控制初始质量浓度为5?g/L,发酵过程中采用pH-stat方式补料。在此基础上利用5?L发酵罐进行发酵产酶,酶活力最高可达1?109.8?U/mL,OD600?nm达到106.3。全细胞催化100?g/L?L-天冬氨酸,反应10?h物质的量转化率为99.2%。构建的重组菌经发酵优化后具有较高的细胞浓度和PanD活力,为生物法β-丙氨酸的工业化生产与应用提供理论支持。     

桃儿七内生真菌产鬼臼毒素发酵条件研究

对鬼臼毒素(Podophyllotoxin)产生菌Ty的发酵培养基及发酵条件进行优化研究。结果表明。优化的半合成培养基组成为:可溶性淀粉2%,蔗糖2%.蛋白胨0.1%,酵母膏0.1%,K_2HPO_4 0.1%.NaCl 0.1%,pH 6.5,装液量80 mL/250 mL三角瓶,接种量2.5%,发酵培养6d,细胞干重为8.5g/L,鬼臼毒素产量达2.418μg/L.     

重组枯草芽孢杆菌分泌表达腺苷酸脱氨酶

目的：利用基因重组技术,构建腺苷酸脱氨酶高效表达的重组菌株。方法：以前期构建的产腺苷酸脱氨酶重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28α-AMPD中来源于鼠灰链霉菌（Streptomyces murinus）目的基因为模板,设计特异性引物扩增腺苷酸脱氨酶基因,亚克隆至游离型表达载体pHY-WZX,转化枯草芽孢杆菌WB600。结果：成功筛选获得了一株产腺苷酸脱氨酶重组枯草芽孢杆菌WB600/pHY-AMPD,进一步在摇瓶中探究了发酵培养基成分对重组酶发酵的影响。获得了较优发酵培养基为：葡萄糖10 g/L、 酵母膏30 g/L、CaCl2 0.5 g/L、柠檬酸三钠1 g/L、NaH2PO4 10 g/L、K2HPO4 10 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L,37 ℃、200 r/min发酵60 h摇瓶发酵液酶活力可达到（2 230±50） U/mL。结论：本研究实现了鼠灰链霉菌来源的腺苷酸脱氨酶基因在枯草芽孢杆菌中表达。