生物转化法应用重组谷氨酰转肽酶合成L-茶氨酸

构建了一个高效表达大肠杆菌来源的GGT重组质粒pET28a-GGT并转化E.coli BL21 (DE3),工程菌株经0.2mmol/L IPTG,20℃诱导表达8h,粗酶液的酶活达到1.5U/mL,大约是出发菌株E.coli K-12的26倍.工程菌粗酶液以267mmol/L L-谷氨酰胺和2.0mol/L乙胺作底物,37℃、pH10.0条件下反应4h,L-茶氨酸的生成量达到26.9g/L,L-谷氨酰胺的转化率为57.8%.     

重组蔗糖异构酶的制备及应用条件优化

对重组菌株E.coli BL21(DE3)/p ET-24a-pal I摇瓶发酵产酶进行研究,探讨了3 L发酵罐中不同乳糖诱导浓度对菌体高密度发酵产酶的影响。结果表明,摇瓶发酵得到胞外上清酶活253.1 U/m L,3 L发酵罐高密度发酵时,在0.4 g/(L·h)乳糖诱导浓度下,发酵上清酶活可达到最大值654 U/m L。对重组蔗糖异构酶转化蔗糖生成异麦芽酮糖的酶转化条件进行了优化,结果表明,当底物浓度为400 g/L,反应初始p H 6.5,温度30℃,加酶量20 U/g蔗糖,转化时间8 h,异麦芽酮糖可以达到最大转化率87.9%。     

嗜酸芽孢杆菌普鲁兰酶在大肠杆菌中的表达及发酵优化

为了在3L发酵罐水平上提高重组菌E.coli BL 21(DE3)/pET20b(+)-BapulA的普鲁兰酶的表达量和胞外分泌,将嗜酸芽孢杆菌普鲁兰酶(Bacillus acidopullulyticus)在大肠杆菌中进行重组表达,并在3L发酵罐水平上对重组菌进行发酵优化,考察了发酵条件对重组酶表达的影响。重组菌发酵的最佳条件为:发酵前期菌体生长温度和pH分别为30℃和7.0,当菌体浓度OD_(600)达到50时,发酵温度降低至25℃,此时调节pH为6.2,同时开始流加乳糖[0.4g/(L·h)]进行诱导;在发酵过程中,当菌体浓度OD_(600)依次达到15,45,75时,分别加入浓度为1.5g/L的甘氨酸,当菌体OD600为105时,再加入浓度为3g/L的甘氨酸。发酵结束后普鲁兰酶的胞外酶活达659.0U/mL,最高总酶活达1 910.1U/mL,与摇瓶的初始总酶活(41.1U/mL)和胞外酶活(6.5U/mL)相比,分别提高了45.4倍和100倍。     

蛋白质谷氨酰胺酶在毕赤酵母中的异源表达

蛋白质谷氨酰胺酶(protein glutaminase, PG)可水解蛋白质侧链的谷氨酰胺残基,生成氨和蛋白质-L-谷氨酸,从而增加负电荷、降低蛋白等电点,进而改善蛋白质的功能特性。但其生产菌株解朊金黄杆菌的产酶量较低,仅有0.258 U/mL,且基因操作效率低,故近年来多采用异源表达的方法,以提高其产量。该实验成功实现蛋白质谷氨酰胺酶酶原(Pro-PG)在毕赤酵母GS115中异源表达,还进行了培养基优化及重组酶学性质的研究。结果表明：重组毕赤酵母pPIC9K-Pro-PG/GS115在摇瓶水平经1%(体积分数)甲醇诱导120 h,表达出的Pro-PG经胰蛋白酶加工后,PG酶活力达到0.878 U/mL。酶学性质研究发现,重组的PG最适作用温度为60℃,在不超过60℃时孵育1 h其相对酶活力可保持在80%以上;该酶作用的最适pH为6.0,在pH 3.0～8.0条件下孵育1 h其相对酶活力可保持在70%以上。     

转谷氨酰胺酶高产突变株的紫外线诱变选育及发酵条件研究

以茂源链霉菌为出发菌株,对其进行紫外线诱变,通过初筛复筛,选育出性能稳定的高产突变菌株G-17,其酶活力达到0.86U/mL,相对于出发菌株提高了2.4倍。对影响突变菌株G-17摇瓶液态发酵条件进行了研究,确定发酵的最佳条件为:培养基初始pH为7.0,100μg/L CaCl2,接种量10%(V/V),发酵温度30℃,转速200r/min,摇床震荡培养48h;最佳发酵条件下,发酵液中转谷氨酰胺酶活力达到1.27U/mL。     

β-甘露聚糖酶高产菌株发酵条件优化

从土壤中分离出1株产β-甘露聚糖酶的优良菌株Bacillus sp.QYW-1,具有发酵周期短且产酶活力高等特性,初始酶活力21.85 U/mL。在单因素实验对培养基及培养条件优化的基础上利用Plackett-Burman实验设计对影响产酶的重要因素进行筛选。实验发现,影响该菌株产酶的重要因素是魔芋粉、蛋白胨及硫酸镁。最陡爬坡实验和Box-Behnken实验得到响应面(RSM)优化的最佳培养基为:魔芋粉26 g/L,蛋白胨10 g/L,MgSO43.8 g/L,NaCl 10 g/L,KCl 6 g/L,NaNO36 g/L,K2HPO43 g/L,初始pH6.5。在此条件下菌株发酵产β-甘露聚糖酶酶活力为233.86 U/mL,与模型预测值相符,与单因素优化后的酶活力115.62 U/mL相比,提高了102%。     

重组蔗糖异构酶在短短芽孢杆菌中的表达及发酵优化

对重组菌株Brevibacillus choshinensis/pNCMO2-SI摇瓶发酵产蔗糖异构酶进行研究,进一步探讨了3 L发酵罐不同发酵条件对菌体生长及产酶的影响。结果表明,摇瓶发酵后胞外酶活为50 U/mL,最优3 L发酵罐培养条件为:初始碳源为葡萄糖质量浓度10 g/L,初始氮源为多聚蛋白胨、牛肉浸膏质量浓度各15 g/L,发酵温度30℃,溶氧30%,在此条件下得到的最高酶活为275 U/mL。为了探索启动子对蔗糖异构酶表达的影响,分别选取来源于枯草芽孢杆菌的启动子Papr-E,Pnpr-E,Pamy以及来源于巨大芽孢杆菌的启动子Pxyl进行研究。结果表明,使用启动子Papr-E的表达量最高。进一步优化摇瓶发酵条件,重组菌株BCpNapr-SI摇瓶发酵的胞外上清酶活为137 U/mL,在此条件下进行3 L发酵罐发酵,最终发酵上清胞外酶活为485.5 U/mL,是未优化启动子的1.76倍。     

基于角质酶共表达策略的大肠杆菌胞外生产耐高温α-淀粉酶及其发酵条件优化

在前期工作中通过分子改造提高了来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶在高温酸性条件下的稳定性,同时改良了催化效率。为了实现α-淀粉酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的胞外高效表达,作者尝试采用共表达嗜热放线菌(Thermobifida fusca)角质酶来增强大肠杆菌膜透性,同时优化诱导策略以提高重组α-淀粉酶的胞外表达。首先构建了能同时表达角质酶和α-淀粉酶的工程菌BL21(DE3)/pETDuet-amy-cutinase,并将此菌株与能单独表达α-淀粉酶的工程菌BL21(DE3)/pET-20b-amy进行摇瓶和3 L发酵罐的产酶发酵对比。结果显示,共表达菌株在胞外产酶方面具有明显的优势。进一步对共表达菌株的诱导条件进行优化,在32℃、诱导剂为0.15μmol/L IPTG与0.5 g/(L·h)乳糖条件下,发酵32 h后胞外α-淀粉酶最高酶活力可达6.05×10~4U/m L,是单表达菌株摇瓶发酵水平的28.3倍。此时胞外重组α-淀粉酶质量浓度为8.92 g/L,重组蛋白质的分泌效率为93.2%。     

产琼胶酶菌株NBRC102603发酵条件优化及酶的分离纯化

通过正交试验对产琼胶酶海洋菌株NBRC102603发酵条件进行了优化,优化得到的发酵产酶条件为:蛋白胨浓度5.0 g/L、酵母膏浓度1.25 g/L、琼胶浓度4.0 g/L、装瓶量100 mL、接种量1%、转速150 r/min,28℃下发酵48 h后酶活力达到58.94 U/mL,比未优化前提高了2.08倍。经纯化得到琼胶酶A和琼胶酶B,琼胶酶A纯化倍数为17.29倍,酶比活力为870.51 U/mg;琼胶酶B纯化倍数为16.65倍,酶比活力为838.39 U/mg。纯化后琼胶酶经SDS-PAGE检测,显示为单一条带,其相对分子质量酶A约为83.6 ku、酶B约为36.8 ku。     

谷氨酰胺酶基因的克隆、表达和酶学性质研究

以枯草芽孢杆菌基因组为模板通过PCR扩增获得谷氨酰胺酶基因ylaM,构建重组质粒p MA5-ylaM,将其转化到枯草芽孢杆菌168中获得重组菌BS168/pMA5-ylaM,并在宿主菌成功得到表达,纯化后的谷氨酰胺酶比酶活大小为939.48 U/mg。谷氨酰胺酶的反应最适pH为7.5,反应最适温度为55℃,La~(3+)、Zn~(2+)、Fe~(3+)和Al~(3+)对谷氨酰胺酶活力具有一定的抑制作用,在NaCl浓度为15%～17.5%的条件下,该酶酶活力可以保留50%以上。在5 L罐中,通过分批补料发酵,其最高酶活力产量为215.06 U/mL。     

解淀粉芽孢杆菌psd基因过表达对胞苷发酵的影响

以解淀粉芽孢杆菌BG-09(Bacillus amyloliquefaciens BG-09)为出发菌株,分析代谢途径中与细胞膜渗透性有关的基因psd,研究过表达基因psd对胞苷发酵的影响。以解淀粉芽孢杆菌BG-09基因组为模板克隆psd,构建了含psd的重组质粒pHT43-psd,通过化学转化法转入菌株大肠杆菌DH5α,验证成功后将其转入B.amyloliquefaciens BG-09,获得重组菌株B.amyloliquefaciens BG-09-psd。将B.amyloliquefaciens BG-09-psd菌株通过摇瓶发酵,研究过表达基因psd对菌体的生长、胞苷和尿苷产量积累的影响。结果显示,重组菌株B.amyloliquefaciens BG-09-psd发酵液中胞苷浓度为1.199 g/L,与对照菌株B.amyloliquefaciens BG-09相比,提高了15.51%,尿苷浓度为0.552 g/L,增加了6.56%,表明过表达基因psd可促进胞苷的积累。     

耐高温α-淀粉酶高密度高表达发酵条件的优化

通过摇瓶实验对产耐高温α-淀粉酶的重组菌E.coli BL21的高密度高表达发酵条件进行研究。考察不同培养基和不同发酵条件对该菌株产耐高温α-淀粉酶的影响,并利用正交试验进行优化。结果表明:在葡萄糖0.5g/L,酵母粉15g/L,pH6.5,诱导时机为接种后发酵4h,诱导时间为6h,IPTG添加量为0.8mmol/L,接种量为体积分数3%的优化条件下,该重组菌发酵液菌体生物量为原来的1.29倍,酶活力达到8.754U/mL,是原来的1.55倍,目的蛋白的表达量也为原来的1.24倍。     

响应面法优化产β-内酰胺酶菌Bacillus cereus B03的发酵条件

为快速高效地提高菌株Bacillus cereus B03的产酶能力,采用响应面法对Bacillus cereus B03产β-内酰胺酶的发酵培养基进行优化。首先通过单因素实验研究了不同碳源及浓度、不同氮源及浓度、不同金属离子及浓度、氯化钠、磷酸氢二钾以及温度、pH、接种量、装液量对菌株产酶活力的影响,然后设计Plackett-Burman试验筛选出影响产酶的3个显著性因素:温度、pH、接种量。在此基础上,最后设计Box-Behnken中心组合试验确定最优产酶发酵条件。结果表明,最佳发酵培养基成分为葡萄糖20 g/L、酵母浸粉20 g/L、NaCl 2 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L,K₂HPO₄·3H₂O 4 g/L,最佳产酶发酵条件为发酵温度37 ℃,pH为7.3,接种量3%,装液量50 mL/250 mL。在此优化条件下,该菌株产β-内酰胺酶的酶活力为113278.7 U/mL,为优化之前酶活(88792.7 U/mL)的1.28倍。本研究为进一步工业化开发利用性状稳定且高产β-内酰胺酶的菌株提供借鉴。     

特基拉芽孢杆菌来源β-1,3-1,4-葡聚糖酶重组菌发酵培养基的优化

为了提高重组大肠杆菌(Escherichia coli BL21DE3)(pET-28a(+)-bgl)发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的能力,研究了发酵培养基中各类碳源及氮源的影响,并通过响应面分析法优化培养基各组分的含量。结果表明,甘油为最适碳源,酵母粉及胰蛋白胨为氮源。优化的培养基组成是:yeast extract终浓度为20 g/L,胰蛋白胨12.5 g/L,甘油14.1 mL/L,KH2PO42.17 g/L,K2HPO42.74 g/L。三角瓶发酵产β-葡聚糖酶酶活(2 978.2 U/mL),与初始培养基(1 671.9 U/mL)相比,提高了1.78倍。研究结果表明,发酵培养基的优化对重组大肠杆菌发酵生产工业酶具有重要作用。     

嗜碱性芽孢杆菌产高碱碱性蛋白酶发酵培养基及发酵条件的研究

对一株高产高碱碱性蛋白酶的嗜碱性芽孢杆菌的发酵培养基及发酵工艺进行了优化。确定了发酵培养基所采用的棉籽饼粉最适粒度为 80目 ,麦芽糊精的最佳DE值为 3 0 %。并确定了该菌株的最适发酵培养基配方为 ( g/1 0 0mL) :棉籽饼粉 3 ,酵母浸粉 1 75 ,麦芽糊精 1 0 ,柠檬酸钠 0 3 ,CaCl2 0 3。K2 HPO4 1 ;最适摇瓶发酵条件为 :种龄 1 2h ,接种量 2 %,装液量 5 0mL/2 5 0mL ,摇床转速 2 0 0r/min ,3 4℃ ,发酵 5 4h ,碱性蛋白酶的发酵单位可达 3 3 985u/mL ,比优化前提高了5 4 48%。此外 ,还进行了 5L罐放大实验 ,在 5L罐所确定的最适工艺条件下 ,发酵单位可达3 65 79u/mL。     

重组大肠杆菌产谷氨酰胺转氨酶培养基及发酵条件优化

对已构建好的表达谷氨酰胺转氨酶的大肠杆菌Rosetta DE3的摇瓶培养条件及发酵条件进行优化,所获优化培养基配方为葡萄糖4.0g/L,酵母膏3.0g/L,NH4Cl 4.0g/L,Na2HPO42.0g/L,K2HPO41.0g/L,MgSO4.7H2O 1.0g/L,NaCl 3.0g/L。得菌株发酵培养的最佳优化条件为装液量为25mL,接种量为5%,加IPTG浓度为0.6mmol/L,诱导时间为4h。     

D-阿洛酮糖3-差向异构酶在大肠杆菌内的高效可溶性表达及发酵条件研究

将来源于Clostridium bolteae ATCCBAA-613的DAEase基因序列经密码子优化合成,以pCold TF为表达载体,冷休克启动子CspA低温诱导DAEase基因在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21 （DE3）中表达,得到高效可溶性的重组Cb-DAEase并利用镍柱亲和层析分离纯化。结果表明,Cb-DAEase最适pH和温度为7.0和55 ℃,Co2+能够显著（P<0.05）增强酶活力。对培养条件进行优化得到,在7 g/L甘油、10 g/L酵母膏、1%接种量、0.25 mmol/LIPTG、诱导前培养5 h的条件下,Cb-DAEase活力达到（10.11±0.02）U/g,比优化前(1.38±0.01) U/g提高了7.33倍;以120 g/L的D-果糖为底物全细胞催化0.5 h后,D-阿洛酮糖产量为（11.47±0.04）g/L,比优化前（1.03±0.02）g/L提高了11.14倍。基于冷休克表达策略构建的重组菌经发酵优化后Cb-DAEase活力显著（P<0.05）提高,为高效制备D-阿洛酮糖提供了理论支持。     

特基拉芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶的异源表达及高密度发酵

L-天冬氨酸α-脱羧酶（L-aspartate α-decarboxylase,PanD）能选择性脱去L-天冬氨酸的α-羧基生成β-丙氨酸,具有重要的工业应用价值。以特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）PanD37的基因组为模板,扩增PanD表达基因panD,构建表达质粒pET32a（＋）-panD,转入Escherichia coli BL21（DE3）成功实现异源表达。利用摇床和发酵罐优化培养条件实现高密度发酵,确定最佳培养条件为：37?℃培养8?h,加入终浓度0.5?mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）降温至26?℃诱导,采用葡萄糖为碳源并控制初始质量浓度为5?g/L,发酵过程中采用pH-stat方式补料。在此基础上利用5?L发酵罐进行发酵产酶,酶活力最高可达1?109.8?U/mL,OD600?nm达到106.3。全细胞催化100?g/L?L-天冬氨酸,反应10?h物质的量转化率为99.2%。构建的重组菌经发酵优化后具有较高的细胞浓度和PanD活力,为生物法β-丙氨酸的工业化生产与应用提供理论支持。     

桃儿七内生真菌产鬼臼毒素发酵条件研究

对鬼臼毒素(Podophyllotoxin)产生菌Ty的发酵培养基及发酵条件进行优化研究。结果表明。优化的半合成培养基组成为:可溶性淀粉2%,蔗糖2%.蛋白胨0.1%,酵母膏0.1%,K_2HPO_4 0.1%.NaCl 0.1%,pH 6.5,装液量80 mL/250 mL三角瓶,接种量2.5%,发酵培养6d,细胞干重为8.5g/L,鬼臼毒素产量达2.418μg/L.     

重组枯草芽孢杆菌分泌表达腺苷酸脱氨酶

目的：利用基因重组技术,构建腺苷酸脱氨酶高效表达的重组菌株。方法：以前期构建的产腺苷酸脱氨酶重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28α-AMPD中来源于鼠灰链霉菌（Streptomyces murinus）目的基因为模板,设计特异性引物扩增腺苷酸脱氨酶基因,亚克隆至游离型表达载体pHY-WZX,转化枯草芽孢杆菌WB600。结果：成功筛选获得了一株产腺苷酸脱氨酶重组枯草芽孢杆菌WB600/pHY-AMPD,进一步在摇瓶中探究了发酵培养基成分对重组酶发酵的影响。获得了较优发酵培养基为：葡萄糖10 g/L、 酵母膏30 g/L、CaCl2 0.5 g/L、柠檬酸三钠1 g/L、NaH2PO4 10 g/L、K2HPO4 10 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L,37 ℃、200 r/min发酵60 h摇瓶发酵液酶活力可达到（2 230±50） U/mL。结论：本研究实现了鼠灰链霉菌来源的腺苷酸脱氨酶基因在枯草芽孢杆菌中表达。