毕赤酵母不同甲醇利用表型Mut~+和Mut~s表达FsGLUm基因的比较

将来源于产琥珀酸丝状杆菌的β-葡聚糖酶基因根据毕赤酵母的偏好性进行密码子优化,通过全基因合成该优化基因(Fs GLUm)并构建重组表达载体p PIC9K-Fs GLUm。将p PIC9K-Fs GLUm分别用SalⅠ和BglⅡ酶切线性化后电击转化入毕赤酵母GS115染色体DNA中,经过表型筛选和抗性筛选获得不同甲醇利用表型Mut+和Muts阳性菌株。经刚果红平板检测,在摇瓶水平下,Mut+型菌株表达产物产生的水解透明圈明显大于Muts型菌株表达产物。在发酵罐水平下,Mut+型菌株各时间段表达产物酶活性明显高于Muts型菌株。Mut+型菌株表达的酶活性在甲醇诱导96h达到最大值,为6424U/m L,比活性为2607U/mg,菌体干重为123.6g/L。Muts型菌株表达的酶活性在诱导后108h达到最大值,为119U/m L,比活性为1867U/mg,菌体干重为113.5g/L。以上结果表明,Mut+型毕赤酵母更有利于产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的表达。     

毕赤酵母不同甲醇利用表型Mut+和Muts表达FsGLUm基因的比较

将来源于产琥珀酸丝状杆菌的β-葡聚糖酶基因根据毕赤酵母的偏好性进行密码子优化,通过全基因合成该优化基因（Fs GLUm）并构建重组表达载体p PIC9K-Fs GLUm。将p PIC9K-Fs GLUm分别用SalⅠ和BglⅡ酶切线性化后电击转化入毕赤酵母GS115染色体DNA中,经过表型筛选和抗性筛选获得不同甲醇利用表型Mut+和Muts阳性菌株。经刚果红平板检测,在摇瓶水平下,Mut+型菌株表达产物产生的水解透明圈明显大于Muts型菌株表达产物。在发酵罐水平下,Mut+型菌株各时间段表达产物酶活性明显高于Muts型菌株。Mut+型菌株表达的酶活性在甲醇诱导96h达到最大值,为6424U/m L,比活性为2607U/mg,菌体干重为123.6g/L。Muts型菌株表达的酶活性在诱导后108h达到最大值,为119U/m L,比活性为1867U/mg,菌体干重为113.5g/L。以上结果表明,Mut+型毕赤酵母更有利于产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的表达。      

响应曲面法优化rmHSA-GCSF的发酵工艺

采用Plackett-Burman设计法对影响巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)的主要参数进行了摇瓶试验,选取到3种显著效应的因素:诱导pH、甲醇添加浓度和诱导时间。再利用响应曲面法(Response surface method)对这3种因素进行进一步研究,得到最佳培养条件:甲醇诱导浓度为2.45%,诱导pH为5.54,诱导时间为66.4 h。采用此优化参数,rm HSA-GCSF表达量的最大预测值达157.5 mg/L。此后,根据优化的培养条件,进行150 L发酵罐放大试验,rm HSA-GCSF表达量达到600 mg/L左右,成功实现rm HSA-GCSF的高效表达。     

游离型质粒在毕赤酵母中表达人溶菌酶的研究

构建一种表达人溶菌酶的游离型毕赤酵母工程菌。巴斯德毕赤酵母表达质粒多以整合型质粒为主,整合型毕赤酵母表达外源基因时,外源蛋白的表达量会随着基因整合拷贝数的增加而增加,而对于毕赤酵母而言,稳定的游离型载体更有利于进行外源基因突变文库的构建及高通量筛选。该文将来自乳酸克鲁维酵母中的自主复制序列(pARS)与酵母表达载体pPICZαA连接,得到游离型表达载体pPICZαA-pARS。将优化后的人溶菌酶基因hLYZ连接至该载体中,构建重组表达载体pPICZαA-hLYZ-pARS。重组载体经电转化以游离形式转入毕赤酵母菌株X33中。摇瓶发酵结果显示诱导72 h后,发酵上清液酶活性为340 U/mL。利用镍亲和层析从发酵上清液中纯化人溶菌酶,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法测定后纯化后的蛋白质量浓度为0.954 mg/mL。该研究成功构建了分泌表达具有生物活性的人溶菌酶的游离型毕赤酵母工程菌,为日后利用现代生物技术突变获得更高抗菌活性、更广抗菌谱人溶菌酶的研究奠定了基础。     

非甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶的条件优化

以1株表达木聚糖酶的重组毕赤酵母为试材,首先优化了甲醇诱导的培养条件,进而采用甲酸铵作为诱导剂,联合山梨醇或者甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶。结果表明,甲醇诱导时木聚糖酶活力最高达到3 403.8 U/mL,单位细胞浓度活力为97.5 U/mL OD600。甲酸铵诱导毕赤酵母醇氧化酶1启动子的强度为甲醇诱导时的40.9%。联合0.5%甲酸铵和0.5%山梨醇时木聚糖酶活力为2 032.0 U/mL,单位细胞浓度的木聚糖酶活力为甲醇诱导时的1.54倍。这表明甲酸铵可以作为非甲醇诱导剂诱导毕赤酵母表达外源蛋白,并且联合山梨醇可以使重组毕赤酵母高效表达外源蛋白。     

共表达N-乙酰转移酶和磷脂酶重组菌的构建及发酵优化

为了提高磷脂酶在毕赤酵母中的表达量,构建了N-乙酰转移酶(Mpr1)和磷脂酶共表达的重组毕赤酵母。Mpr1是一类能催化乙酰基团在乙酰辅酶A和胺之间转移的胞内酶,能够降低酵母细胞内的ROS水平,具有抗活性氧(ROS)氧化胁迫生理功能。来源于尖孢镰刀菌的磷脂酶(phospholipase)是一类可以将磷脂水解为小分子脂肪酸、甘二酯和磷酸胆碱的胞外酶。研究了Mpr1对重组菌的生长和磷脂酶表达量的影响。为了获得在3.6 L发酵罐中表达磷脂酶的最佳发酵条件,分别从诱导温度、起始诱导菌体浓度和甲醇诱导浓度3个方面研究了重组菌的高密度发酵,以恒溶氧反馈调节补加甘油和甲醇流加仪在线监测流加甲醇。结果表明:当诱导温度、起始诱导菌体质量浓度和甲醇诱导体积分数分别为28℃,40 g/L和1.0%,诱导120 h后磷脂酶活达到最高,为8 100 U/mL,总蛋白含量为8.3 mg/mL,为前期工作中磷脂酶单独表达时的1.33倍。     

基于自联想神经网络的毕赤酵母发酵过程两阶段故障诊断

在毕赤酵母表达人血清白蛋白-人白介素-2融合蛋白(IL-2-HSA)过程中,诱导期甲醇浓度和pH值直接影响了IL-2-HSA表达量的高低和发酵过程的稳定。为了准确有效的控制这两个参数,本论文基于毕赤酵母诱导期的生理学特性和过程参数特征,提出了基于自联想神经网络的毕赤酵母表达IL-2-HSA过程的诱导期两阶段故障诊断。研究结果表明该诊断系统能够在线快速准确地诊断出毕赤酵母诱导期的各种故障。当系统提示出现故障时,离线分析,对比最优的pH值和甲醇质量浓度变化曲线,确定故障类型,采取相应措施。     

烟曲霉壳聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

为了筛选高效表达壳聚糖酶的毕赤酵母菌株。重组质粒pPIC9K-CSN经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,表型筛选Mut+转化子,PCR鉴定后,用G418梯度浓度筛选多克隆子,用甲醇诱导摇瓶分泌表达。经PCR分析,质粒转到宿主菌GS115,在G418为4mg/mL时,筛选到了多克隆子,经SDS-PAGE分析表明分泌表达蛋白的相对分子量约为25kDa,酶活为14.59 U/mL。     

重组毕赤酵母发酵生产α-葡聚糖酶的放大研究

研究了毕赤酵母高密度发酵组成型表达α-葡聚糖酶,从6.8 L发酵罐逐级放大至5000 L发酵罐的放大工艺。采用恒定p H和控制甘油残留浓度和溶解氧相结合的调控策略,进行了多批次的发酵试验。结果表明:三磷酸甘油醛脱氢酶启动子驱动的α-葡聚糖酶的生成具有生长偶联特征,集中在对数生长期和稳定期。6.8 L发酵罐中上清酶活达1253 U/m L,中试放大至50 L发酵罐中产酶最高达1300 U/m L,500 L发酵罐中酶活为740 U/m L。5000 L规模发酵罐中产酶达到589 U/m L。建立了以甘油作为碳源,发酵调控简单的工艺,避免了使用甲醇带来的安全问题,适合放大生产。     

Muts型基因重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中甲醇流加的控制

在采用Muts 表型基因重组巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)发酵生产血管生长抑制因子(angiostatin)的过程中 ,诱导表达阶段甲醇的质量浓度对血管生长抑制因子的表达至关重要 .因重组Muts 型巴斯德毕赤酵母利用甲醇极慢 ,按文献方法流加甲醇时 ,甲醇逐渐积累达 30 g/L ,血管生长抑制素表达水平仅为 4mg/L .采用甲醇检测与控制系统对甲醇流加进行反馈控制后 ,甲醇质量浓度可稳定控制在设定范围 .采用此系统控制诱导阶段的甲醇流加 ,同时手动流加适量甘油以促进细胞生长 ,血管生长抑制因子表达水平量最高可达 89mg/L .     

The effect of ethanol and acetate on protein expression in Pichia pastoris

Pichia pastoris is an excellent host for high-level heterologous gene expression, but there is still much interest in improving the productivity of recombinant protein production. P. pastoris produces a small amount of ethanol as a by-product during the glycerol fed-batch phase and the mixed-feed induction phase (glycerol-methanol) of high cell density fermentations, regardless of the phenotype (Mut+, Mut(s), or Mut-). We have nvestigated ethanol repression of the AOX1 promoter using strains, GS115 (Mut+) and MC100-3 (Mut-), expressing an AOX1-lacZ fusion. The addition of 10 mg l(-1) ethanol at the start of methanol induction delayed beta-galactosidase production and methanol utilization for four hours in shake flask experiments. When ethanol and acetate were added together, all of the ethanol was converted to acetate, which also represses the AOX1 promoter. The effects of ethanol and acetate on protein expression in P. pastoris at shake flask and fermentor conditions are discussed.     

RT-qPCR分析拷贝数及mRNA转录水平对表达左聚糖蔗糖酶的影响

采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）技术对重组毕赤酵母基因组中左聚糖蔗糖酶基因（SacB）的拷贝数及信使核糖核酸（mRNA）转录水平进行检测分析,并用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定菌株不同诱导时间下左聚糖蔗糖酶水解活力。结果表明,在BMMY液体培养基中经甲醇诱导24 h时,样品转录水平皆达到最大值,此时多拷贝菌株转录水平（2.13）为单拷贝菌株（0.42）的5.1倍;左聚糖蔗糖酶活力在甲醇诱导24 h后均随诱导时间不断上升,多拷贝菌株酶活（13.96 U/mL）较单拷贝菌株（5.48 U/mL）提高1.5倍。重组毕赤酵母整合的左聚糖蔗糖酶基因在1～3个拷贝范围内,随着拷贝数增加,多拷贝菌株较单拷贝菌株的mRNA转录水平及相应的蛋白表达量均显著增加（P＜0.05）,说明毕赤酵母是表达基因SacB的良好宿主。     

重组毕赤酵母产a-葡聚糖酶甲醇流加控制的研究

本文在摇瓶发酵的基础上,利用5L发酵罐进行重组毕赤酵母甲醇诱导产Ⅸ．葡聚糖酶发酵条件的优化。结果表明,菌体湿重250g／L时开始诱导,诱导表达阶段溶氧控制在10％～20％,甲醇诱导90h时仪．葡聚糖酶酶活达330U／mL。     

重组毕赤酵母表达人血清白蛋白-人白介素2融合蛋白过程的代谢特性

分析了重组甲醇营养型毕赤酵母在5L多参数自控发酵罐上生产人血清白蛋白-人白介素2融合蛋白(HSA-IL-2)的发酵过程。在使用多种在线传感器和离线检测参数的基础上,应用相关性分析的方法将细胞生长的关键酶(乙醇氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶)酶活和代谢特性相关联。实验结果显示,甲醇诱导后葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的酶活分别下降了46.1%和66.8%,说明胞内代谢流发生了迁移:三羧酸循环(TCA)和磷酸戊糖途径(HMP)中代谢流通量下降,甲醇完全氧化代谢成为主要代谢流。此外,在不同控制策略下,乙醇氧化酶的酶活和重组蛋白HSA-IL-2表达量也呈现出一定的差异。高溶氧低甲醇控制方式下HSA-IL2的表达量达到27mg/L,比低溶氧高甲醇条件下的表达量高33.7%。     

毕赤酵母流加培养诱导生产植酸酶的流加控制策略

对毕赤酵母流加培养生产植酸酶过程中的底物和诱导剂流加策略和性能进行了比较研究。在生长期采用基于DO/pH在线测量的人工神经网络状态模式识别控制法(ANNPR-Ctrl)特别有效。它可大幅度提高细胞生产强度,并使以甲醇为诱导剂的植酸酶诱导生产时刻提前。然而,在诱导期ANNPR-Ctrl和pH-Stat法等均不能有效地提高植酸酶酶活。为此,在生长阶段采用ANNPR-Ctrl法,当菌浓达到一个较高水平后,引入一个5~6 h的过渡期,并在此阶段继续利用ANNPR-Ctrl法流加葡萄糖和甲醇的混合物,使细胞对甲醇逐步产生适应。最后,利用纯甲醇和离线检测甲醇的控制方法开始诱导。在此阶段,离线控制可粗略地将甲醇浓度控制在5~15 g/L的范围内,酶活高达320 U/mL,比3种基本控制方式提高了5倍。同时,ANNPR-Ctrl法和离线检测甲醇控制模式的有效组合还缩短了酶活达到最高水平的时间。     

粗糙脉孢菌漆酶基因的克隆及在毕赤酵母中的初步表达

采用连续延伸PCR方法克隆到粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）漆酶基因，并将其克隆到表达载体pPIC9k，重组质粒经线性化、电激转化Pichia pastoris KM71，部分阳性克隆的PCR结果表明：漆酶基因已整合到巴斯德毕赤酵母染色体上，重组菌经甲醇诱导后3～5d产漆酶量最高，为2-3U／mL。     

重组毕赤酵母表达蛋清溶菌酶发酵条件的优化

该研究以甲醇诱导型重组毕赤酵母（Pichia pastoris） NCY-2为研究菌株,在摇瓶水平上首先考察了诱导时间、甲醇含量、诱导pH及诱导温度对蛋清溶菌酶表达的影响,然后通过正交试验设计优化出了该菌株的最佳发酵条件,并进一步研究了摇瓶发酵过程中的菌体生长和酶活力随时间的变化规律。研究结果表明,蛋清溶菌酶的最适诱导时间为96 h,甲醇含量为2%,诱导pH值为3.5,诱导温度为20 ℃;在此条件下发酵液的蛋清溶菌酶酶活力达到775 U/mL,是优化前的2.2倍。 关键词：中图分类号：Q815 文章编号：0254-5071（20１7）02-0054-04 doi：     

毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶发酵条件

在50 L发酵罐水平对影响毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)发酵因素进行了研究。最适初始菌体密度(OD600)约为250,最佳诱导pH为6.0;降低诱导温度能有效提高单位甲醇转化率,诱导温度为20℃和25℃时的转化率分别是30℃的1.56倍和1.32倍。在以上最适条件下单位干菌体展示酶活及生产强度分别达275.0 U/g和462.5 U/(L.h),比优化前提高54.5%。研究发现,山梨醇和甲醇混合补料有效地提高了诱导前期(t=12h)的产酶效率,当山梨醇和甲醇混合比例为1∶4及1∶5是以甲醇为单一碳源时酶活力的1.7倍。