近平滑假丝酵母ATCC7330羰基还原酶CpCR突变体酶的稳定性研究

通过蛋白质理性设计和定点突变技术,在近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶wtCpCR的基础上,构建5个突变体酶A98N、S307N、G262N、S216N和S258N,考察了有机溶剂、温度、剪切力、氧气、辅酶NADPH浓度对突变体酶的稳定性影响.研究表明,A98 N在磷酸盐(potassium phosphate...     

热带假丝酵母木糖还原酶的酶学性质研究

研究了从热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌体中获得的木糖还原酶(XR)的酶学性质。实验结果证实,C.tropicalis的细胞浆粗提液经盐析、透析及阴离子交换柱层析后得到的酶液中木糖还原酶比酶活为9·3U/mg、最适酶反应pH为6·0、最适反应温度为35℃;以木糖为底物时,Km·Xyl为64·8mmol/L、Km·N·X为0·0622mmol/L;以阿拉伯糖为底物时,Km·Ara为172mmol/L、Km·N·A为0·0375mmol/L。Zn2+是木糖还原酶的激活剂,Fe3+为抑制剂。固定木糖为反应底物,分别以NADPH及NADH为辅酶测定酶活,实验结果显示该菌体中木糖还原酶的活性主要依赖于辅酶NADPH。     

近平滑假丝酵母发酵产甘露醇

从甘蔗汁中筛选出1株利用葡萄糖产甘露醇的菌株,经鉴定为近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)。研究其发酵生产甘露醇的条件,通过单因素实验和正交实验优化后,培养基配方为:200 g/L葡萄糖,30 g/L酵母膏,0.05 g/L CaCl2·2H2O,0.02 g/L FeCl3·2H2O,0.5 g/L MgSO4·7H2O,此条件下摇瓶培养甘露醇产量为61.7 g/L。进行30 L发酵罐扩大培养,根据发酵曲线得知72 h时甘露醇最大产量为80.3 g/L。     

假丝酵母氨基甲酸乙酯水解酶的分子克隆及酶学性质

氨基甲酸乙酯是存在于发酵食品中的一种潜在致癌物.生物酶法可有效降解氨基甲酸乙酯.该研究从假丝酵母CCTCC AY 2017001基因组中克隆了氨基甲酸乙酯水解酶基因cpUH,并实现了其在Escherichia coli中的高效表达.实验结果表明,cpUH基因大小为1656 bp,编码552个氨基酸;重组蛋白大小约为60...     

克鲁斯假丝酵母ZJB 09162产羰基还原酶的产酶条件

研究了克鲁斯假丝酵母Candida krusei ZJB 09162产羰基还原酶的条件,确定了最适的培养基组成和培养条件:葡萄糖50.0 g/L,酵母膏50.0 g/L,(NH4)2HPO4 2.5 g/L,KH2PO4 2.5 g/L,NaCl 1.0 g/L,培养基初始pH6.0,装液量12%,接种量4%。将此条件下发酵培养60 h的菌体用于(R)-1,3-丁二醇的不对称合成,产物对映体过量值99%,产率85%。     

近平滑假丝酵母补糖发酵及糖氮代谢对产甘露醇的影响

为了探究近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)生长及代谢过程中对碳源和氮源的需求,本文对发酵各阶段的碳源和氮源变化利用情况进行检测,并设定一个空白对照组和四个不同时期的补糖实验组进行研究,分别观测各实验组各时期生物量和甘露醇产量。结果表明,在72 h时进行补糖为最佳时期,甘露醇产量达到最大值为60.28 g/L,相比于空白对照组高出19.82%。通过补糖工艺的研究,在氮源和碳源耗尽时,补糖可以促进甘露醇的产生。本文为以后的工业化生产提供了理论依据。     

酿酒酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的酶学性质研究

本文对酿酒酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)的-般酶争I生质进行研究,得出如下结论:酵母表面展示CALB在碱性条件下具有很好的稳定性和水解活性.其水解对硝基苯酚酯的最适反应pH值范围是8.0～8.5,与游离的CALB商品酶相比,向碱性条件偏移.最适反应温度范围是40～45℃.最适反应底物为对硝基苯酚丁酸酯,表现出极为明显的底物特异性.Ca2 、Mg2 对其有明显的激活作用.K 对其有微弱的激活作用.而Co2 、Cu2 对其有明显的抑制作用.本研究为酵母表面展示脂肪酶的应用研究奠定理论基础.     

褶皱假丝酵母产脂肪酶条件及酶学性质研究

对一株来源于海洋有产脂肪酶能力的褶皱假丝酵母产酶条件进行研究,探讨了碳源、氮源、pH、培养温度对该菌产脂肪酶的影响。结果显示:在摇瓶培养条件下,其最适产酶条件为:蔗糖5 g/L,橄榄油5 g/L,MgSO4·7H2O1 g/L,K2HPO41 g/L,(NH4)2SO410 g/L,起始pH为7.0,接种量10%,在30℃、200 r/min下培养36 h,产酶能力达到4 351.6 U/mL。该菌所产脂肪酶的最适反应pH为7.0,最适反应温度为37℃,Ca2+、Mg2+对酶活有一定的促进作用。     

白假丝酵母环核苷酸磷酸二酯酶2的异源表达、纯化与酶学特性分析

为获得白假丝酵母(Candida albicans)环核苷酸磷酸二酯酶2 (phosphodiesterases 2,PDE2),以C.albicans基因组为模板,经聚合酶链式反应扩增获得目的基因,构建重组质粒pET28a-C.albicans pde2,转化至大肠杆菌BL21中,获得稳定表达的基因工程菌。所表达的蛋白通过亲和层析柱(Ni-NAT)、离子交换层析柱(Q-Sepharose)和分子筛层析柱(Sephacryl S200)逐步进行纯化。应用高效液相色谱方法测定纯化的PDE2蛋白(约62 kDa)对单底物及双底物的水解特性,证明PDE2在0.385 mg/mL质量浓度下,对0.4mmol/L cAMP和cGMP的水解率达到60%～70%,且对底物cAMP具有更高的亲和力,并确定该酶具有较高生物学活性和稳定性,为该蛋白的晶体学解析及在C.albicans中的生理病理机制研究提供理论依据。     

Isolation and expression of the gene encoding mitochondrial ADP/ATP carrier (AAC) from the pathogenic yeast Candida parapsilosis

A gene homologous to Saccharomyces cerevisiae AAC genes coding for mitochondrial ADP/ATP carriers has been cloned from the pathogenic yeast Candida parapsilosis. A probe obtained by PCR amplification from C. parapsilosis DNA, using primers derived from the conserved transmembrane region of yeast ADP/ATP carriers, was used for screening of the C. parapsilosis genomic library. The cloned gene was sequenced and found to encode a polypeptide of 303 amino acids that shows homology with other yeast and fungal mitochondrial ADP/ATP carriers. The gene was designated CpAAC1 and was able to complement the growth phenotypes of S. cerevisiae double deletion mutant (Δaac2; Δaac3). The expression of the CpAAC1 gene was reduced under semi‐anaerobic conditions and it was affected at normal aerobic conditions by the nature of carbon sources used for growth. Hybridization experiments indicate that C. parapsilosis possesses a single gene encoding a mitochondrial ADP/ATP carrier. The GenBank Accession No. for the C. parapsilosis CpAAC1 gene is AF085429. Copyright © 1999 John Wiley & Sons, Ltd.     

PCR‐mediated gene modification strategy for construction of fluorescent protein fusions in Candida parapsilosis

Candida parapsilosis is a common cause of invasive candidiasis, especially in premature infants, even surpassing Candida albicans as the most frequently identified Candida species in some newborn intensive care units. Whereas many molecular tools are available to facilitate the study of C. albicans, relatively few have been developed for C. parapsilosis. In this study, we show that plasmids harbouring green, yellow and mCherry fluorescent protein sequences, previously developed for expression in C. albicans, can be used to construct fluorescent fusion proteins in C. parapsilosis by PCR‐mediated gene modification. Further, the strategy can be used in clinical isolates of C. parapsilosis, which are typically prototrophic, because the plasmids include NAT1, a dominant selectable trait that confers resistance to the antibiotic nourseothricin. Overall, these tools will be useful to yeast researchers who require the ability to visualize C. parapsilosis directly, e.g. in in vitro and in vivo infection models. In addition, this strategy can be used to generate fluorescence in other C. parapsilosis clinical isolates and to tag sequences of interest for protein localization studies. Lastly, the ability to express up to three different fluorescent proteins will allow researchers to visualize and differentiate C. parapsilosis and/or C. albicans clinical isolates from each other in mixed infection models. Copyright © 2015 John Wiley & Sons, Ltd.     

黑曲霉果糖基水解酶的重组表达及酶学特征分析

目的:果糖基转移酶在新型果糖基衍生品的制备过程中具有重要作用,获得酶活高、性能优良的果糖基水解酶是关键。方法:利用MEGA 4.0以及Clustal X2等软件对黑曲霉的基因组进行分析,遴选了5个果糖基水解酶基因,接着将它们在毕赤酵母中进行了克隆表达,并研究了重组酶的酶学性质。结果:在摇瓶水平上,重组酶Fru1和Fru5的酶活分别为1360和1560 U/m L,远高于目前已报道的果糖基水解酶的酶活。重组酶Fru1的最适反应温度和p H分别为45℃和5.5,EDTA对它有微弱的促进作用,Fe²⁺、Na+、Co²⁺、Cu²⁺和Ca²⁺会轻微地抑制酶活,该酶对蔗糖既有水解作用,又有转苷活性,还可以水解菊粉中的二糖到五糖;重组酶Fru5的最适反应温度和p H分别为50℃和5.0,Li⁺、Na⁺和EDTA对其酶活有促进作用,但Fe²⁺则强烈抑制酶的活性,它还可以水解蔗糖以及菊粉中几乎所有的大分子糖。结论:本研究为果糖基水解酶的工业化生产及其在新型果糖基衍生品制备过程中的应用提供了可能途径。      

南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表达及其硅藻土固定化应用

为提高南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B,CALB）表达量,根据黑曲霉（Aspergillus niger）密码子偏好性设计合成CALB基因,以PnaII/tpi为启动子构建CALB表达载体并转化到黑曲霉HL-1中表达,摇瓶发酵120 h后上清液中重组CALB活力为171 U/mL。研究重组CALB的酶学性质,最适反应温度和pH值分别为50 ℃和8.0,在pH 6.0～9.0和45 ℃以下具有较高的稳定性,10 mmol/L Cu2＋、Zn2＋和0.1 g/100 mL十二烷基硫酸钠强烈抑制酶活力,而1 mmol/L Ca2＋、0.1 g/100 mL山梨醇对酶活力具有非常明显的激活作用。此外,以硅藻土为载体固定CALB,固定化酶活力为187 U/g。将制备的硅藻土-CALB固定化酶用于生物合成己酸乙酯,经反应条件优化后在无溶剂体系中己酸乙酯产率达91%。     

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因在大肠杆菌中表达

构建乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒并表达。以植物乳杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,连接到表达载体pET-32a(+)上,构建的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,菌体总蛋白经SDS-PAGE鉴定显示重组质粒诱导表达产物有特异性蛋白条带。该表达产物经细菌亚硝酸盐还原酶试剂盒测定显示有明显的酶活性。实验结果为深入研究植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶提供有益的参考。     

四川泡菜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因克隆与表达

目的:对植物乳杆菌中亚硝酸盐还原酶基因进行克隆并表达,并测定酶的活力。方法:根据Gen Bank中亚硝酸盐还原酶（NIR）基因序列,设计引物。提取植物乳杆菌的DNA,采用PCR技术扩增nir基因,TA克隆构建获得重组质粒p MD19-nir,分析其核苷酸序列同源性。通过双酶切连接到表达载体p ET-32a（+）中,获得重组表达载体p ET-32a-nir,构建成功后转化到E.coli BL（DE3）中进行表达研究。经IPTG诱导表达,得重组蛋白,超声波破碎,提取粗酶液,测定酶活力。结果:克隆的目的基因序列长度为1638 bp。获得重组蛋白分子量为80 ku,酶活力为4.2 U/mg。结论:成功克隆了植物乳杆菌中的亚硝酸盐还原酶基因,成功的导入到E.coli BL（DE3）中,表达产物有酶活。      

分散泛菌胞内脱乙酰酶在大肠杆菌中重组表达条件优化及酶学特性

目的 对分散泛菌的胞内脱乙酰酶(Pantoea dispersa N-acetylglucosamine deacetylase, Pd-nagA)进行表达条件优化及酶学性质分析。方法 本研究使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术对分散泛菌全基因组中Pd-nagA基因序列进行全长扩增,将含有Pd-nagA基因的质粒pET-28a(+)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,同时采用单因素实验,优化诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)的浓度,采用Ni2+-次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid,NTA)进行重组酶的纯化,再对其酶学特性进行测定。结果 以pET-28a(+)质粒作为表达载体,大肠杆菌BL21(DE3)成功表达了可溶形式的Pd-nagA蛋白,分子量约为40 kDa。当诱导温度为28℃,诱导前菌液OD600值为1.2,IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导时间为20 h时,Pd-nagA蛋白得到了大量表达。通过薄层层析法分析表明Pd-nagA重组蛋白能够在体外转化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖,Pd-nagA重组蛋白能够在高盐溶液中保持一半的相对酶活性,该酶储存10 d的相对活性仍然保持在90%以上,具有良好的储存稳定性,催化N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)生成氨基葡萄糖(glucosamine, GlcN)反应条件简单快捷。结论 本研究成功异源表达了具有催化活性的Pd-nagA酶,并对表达条件进行优化及酶学特性探究,可为工业上单酶催化制备氨基葡萄糖提供一定的理论参考。