米诺环素抑制炎症小体介导的细胞焦亡改善阿尔茨海默病小鼠的认知能力研究

目的: 研究米诺环素(minocycline, Mino)抑制炎症小体介导的细胞焦亡改善阿尔茨海默病认知能力的作用机制。方法: 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导大鼠神经细胞株PC12构建神经细胞焦亡损伤模型,将细胞分为对照组、LPS组、LPS+Mino组,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡水平,蛋白免疫印迹法检测炎症小体关键蛋白NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3, NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)、Caspase-1及pro-Caspase-1的水平以及焦亡执行蛋白Gasdermin-D(GSDMD)、p30-GSDMD的水平,酶联免疫吸附法检测培养基中白介素(IL)-1β、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达水平。APP-PS1双转基因小鼠10只,随机分为对照组和实验组,实验组采用50 μg的米诺环素灌胃给药,分别在给药前和给药后3周采用Morris水迷宫实验检测小鼠的认知记忆能力,处死小鼠后取海马CA3区检测组织中NLRP3、ASC、Caspase-1及pro-Caspase-1的蛋白表达,以及炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α、焦亡执行蛋白GSDMD、p30-GSDMD的水平。结果: 米诺环素可以抑制LPS诱导的细胞凋亡,LPS+Mino组细胞活力显著高于LPS组,而细胞凋亡率显著低于LPS组,差异具有统计学意义(P<0.05)。而LPS+Mino组中炎症小体关键蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表达低于LPS组,同时焦亡执行蛋白p30-GSDMD低于LPS组,GSDMD高于LPS组,培养基中IL-1β、IL-18、TNF-α的水平低于LPS组,差异具有统计学意义(P<0.05)。动物实验中,米诺环素可以显著改善小鼠的认知能力;Morris水迷宫实验中,小鼠潜伏期缩短,相比对照组具有统计学意义(P<0.05)。同时小鼠穿越平台次数明显增多,相比对照组具有统计学意义(P<0.05)。实验组小鼠炎症小体关键蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表达低于对照组,同时焦亡执行蛋白p30-GSDMD低于对照组,GSDMD高于对照组,炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α的水平低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论: 米诺环素可以通过抑制炎症小体活化,抑制神经细胞焦亡的发生,同时改善阿尔茨海默病小鼠的认知能力。     

α-突触核蛋白激活NLRP3炎性小体介导神经细胞焦亡的发生

目的:研究α-突触核蛋白（α-synuclein）对于神经细胞焦亡发生的影响和机制。方法:以小鼠海马神经元细胞HT22细胞株为对象,体外培养后用α-synuclein干预细胞,以CCK-8法检测细胞活力,确定IC50值。设置对照组（Con组）后,采用TUNEL染色法检测细胞焦亡水平,免疫荧光法观察Gasdermin-D-N（GSDMD-N）的表达,Western blot法检测细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、细胞凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、Gasdermin-D（GSDMD）、GSDMD-N、Caspase-1的表达水平,酶联免疫吸附法检测培养基中IL-18、IL-1β的表达水平。采用Caspase-1抑制剂预处理HT22后,同样使用IC50值的α-synuclein干预细胞,同时设置α-synuclein组（单纯α-synuclein干预）和α-synuclein+ML132组,检测细胞焦亡的水平。结果:α-synuclein的IC50值为50 nmol/L。α-synuclein干预后细胞焦亡数目显著增高,TUNEL染色显示阳性细胞数目多于Con组,免疫荧光染色结果显示细胞中GSDMD-N的表达水平上调,细胞中NLRP3、ASC、GSDMD-N、Caspase-1的表达水平显著高于Con组,而GSDMD水平下调,同时细胞培养基中IL-18、IL-1β的水平上调。Caspase-1抑制剂处理后,50 nmol/L的α-synuclein干预后,细胞焦亡水平显著低于α-synuclein组,同时免疫荧光染色结果显示GSDMD-N的水平下调,细胞中NLRP3、ASC、GSDMD-N、Caspase-1的表达水平显著低于α-synuclein组,而GSDMD水平上调,培养基中IL-18和IL-1β的水平下调。结论:α-synuclein可以通过激活NLRP3炎性小体活化继发神经细胞焦亡的发生,在帕金森病的发生发展中具有一定的作用。     

巨噬细胞移动抑制因子siRNA对肺泡上皮细胞Toll样受体及其下游信号转导通路的影响

目的: 研究巨噬细胞移动抑制因子siRNA对脂多糖刺激的肺泡上皮细胞Toll样受体(TLR)及其下游信号转导通路的影响和作用机制。方法: 用LPS刺激A549细胞,脂质体法分别将巨噬细胞移动抑制因子(MIF) siRNA和非特异性siRNA加入A549细胞进行干预。RT-PCR法检测MIF和TLR2、TLR4 mRNA的表达,Western Blot法分析TLR下游信号转导通路元件髓样分化因子88(MyD88)和干扰素调节因子3(IRF3)蛋白表达,细胞免疫荧光法观察NF-κB核迁移,ELISA法测定细胞培养上清炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6,免疫介质IFN-β分泌水平。结果: MIF siRNA对LPS刺激诱导的MIF和TLR2、TLR4 mRNA高表达有显著的下调作用和部分阻断NF-κB(p65)核迁移。LPS刺激诱导后,MIF siRNA显著降低MyD88蛋白表达和炎症介质TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平,但MIF siRNA对IRF3蛋白表达和免疫介质IFN-β分泌水平无影响。结论: MIF siRNA能抑制A549细胞的炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6过度分泌,其机制可能是MIF siRNA降低了LPS刺激A549细胞诱导的MIF和TLR2、TLR4高表达,及阻断TLR下游信号转导通路元件MyD88和NF-κB核迁移。     

茵陈术附汤抑制TLR4/NF-κB通路对α-萘异硫氰酸酯诱导肝内胆汁淤积症模型小鼠肝损伤的保护作用

目的: 基于肝细胞Toll样受体4/核因子kappa B(toll-like receptor 4/nuclear factor kappa B, TLR4/NF-κB)通路探讨茵陈术附汤对α-萘异硫氰酸酯(ANIT)所致肝内胆汁淤积模型小鼠肝损伤保护作用。方法: C57BL/6雄性小鼠灌胃茵陈术附汤,每天一次,连续10 d,于第7天灌胃75 mg/kg ANIT油溶液造模,于第11天上午采集血液和肝脏样本。测定血生化、肝脏病理、肝脏中胆汁酸含量的变化及TLR4/NF-κB通路中相关蛋白表达量。结果: 与模型组相比,茵陈术附汤组肝脏坏死明显好转,炎性细胞浸润有所减少;血浆谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)和总胆红素(TBIL)明显下降,肝脏胆汁酸胆酸(CA)、β-鼠胆酸(β-muricholic acid, β-MCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)和牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)含量显著减少;Western blot测定的TLR4和p-NF-κB p65的蛋白表达量显著下降;ELISA检测IL-1β、IL-6、TNF-α和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等细胞因子水平明显降低。结论: 茵陈术附汤对ANIT诱导的小鼠肝内胆汁淤积肝损伤有保护作用,其机制可能与其减少肝内胆汁酸淤积,抑制TLR4/NF-κB通路和抑制炎症反应有关。     

小柴胡汤对化学性肝纤维化小鼠的保护作用

目的:探讨小柴胡汤(XCHD)对四氯化碳(CCl4)诱发的肝纤维化(HF)小鼠的保护作用。方法:采用持续12周,2次/周,20%CCl4小鼠背部皮下注射的方法,复制HF小鼠模型。造模首日起,每天1次,持续12周,灌胃给予3.90、7.80、15.60 g/kg XCHD和0.1 g/kg水飞蓟宾。实验结束后,处置小鼠,检测血清中ALT、AST含量;HE、Masson、天狼猩红染色以及透射电镜观察肝脏病理组织学损伤情况,并进行HF分级评分;免疫荧光、RT-qPCR和免疫印迹技术检测肝组织中α-肌动蛋白(α-SMA)和Ι型胶原(Collagen Ι)水平。结果:XCHD(7.80,15.60 g/kg)组不仅可明显降低血清中ALT、AST水平(P<0.05),减轻肝脏病理学损伤程度,减少胶原纤维沉积,还可显著抑制α-SMA、Collagen Ι mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)。结论:XCHD对化学性HF小鼠具有很好的保护作用。     

细胞焦亡介导慢性间歇缺氧大鼠肾脏损伤及依达拉奉的干预作用

目的：探究依达拉奉对慢性间歇缺氧导致大鼠肾脏损伤的保护作用及其对Caspase-1介导的细胞焦亡信号通路的影响。方法：24只SPF级雄性SD大鼠随机分为正常对照（NC）组、间歇缺氧（IH）组、间歇缺氧+生理盐水（IH+NS）组、间歇缺氧+依达拉奉（IH+EDA）组,每组6只。将4组大鼠放置在密闭式饲养舱内造模,NC组舱内氧气浓度维持在21%左右,IH组、IH+NS组、IH+EDA组定时输入纯氧气、纯氮气、压缩空气,使舱内形成缺氧-复氧循环（60 s低氧期+60 s复氧期）,低氧期舱内氧浓度降至6%～7%,每日造模8 h（10∶00-18∶00）,同时IH+EDA组大鼠每天造模前按照5 mg/kg剂量标准予以腹腔注射依达拉奉,IH+NS组大鼠按照同等剂量标准腹腔注射生理盐水。造模8周后采集大鼠血液标本及肾脏组织标本,测定各组大鼠血肌酐（Crea）、尿素（Urea）水平;HE、Masson染色后光镜下观察肾脏病理形态变化、纤维化程度;化学法测定丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力;免疫组织化学染色法测定肾组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达水平;Western blot法测定肾组织Caspase-1、IL-1β蛋白表达水平;RT-PCR法测定消皮素D（gasdermin D, GSDMD）、IL-18 mRNA扩增水平。结果：间歇缺氧暴露后,大鼠血清Crea、Urea明显升高（P<0.01）,肾小管发生病理损害、肾单位球囊间隙出现胶原纤维沉积,MDA含量增加、SOD活力降低（P<0.01）,Caspase-1、NLRP3、IL-1β蛋白表达增加（P<0.01或P<0.05）、GSDMD mRNA、IL-18 mRNA扩增增加（P<0.01）;而经过依达拉奉干预后,上述指标呈现出与间歇低氧暴露后相反的变化趋势,肾脏病理损害减轻（P<0.01或P<0.05）。 结论：慢性间歇缺氧可能通过氧化应激活化Caspase-1参与的细胞焦亡信号通路介导肾脏损伤过程,而依达拉奉可能通过清除氧自由基、下调机体氧化应激水平,抑制焦亡通路的活化,起到保护肾脏的作用。     

低分子肝素钠对小鼠实验性肝纤维化干预作用的初步研究

目的:探讨低分子肝素钠（LMWH）对四氯化碳（CCl4）诱导的小鼠肝纤维化的干预作用。方法:将30只KM小鼠随机均分为空白对照组（腹腔注射橄榄油8周,n=10）、模型对照组（CCl4腹腔注射8周,n=10）和LMWH治疗组（CCl4腹腔注射+LMWH皮下注射8周,n=10）。8周后处死所有小鼠,收集血清及肝组织样本。检测血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）和透明质酸（HA）水平;行HE染色、Masson三色染色和PSR染色观察肝组织病理形态及胶原纤维沉积情况;免疫组化检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达量;实时聚合酶链反应（RT-PCR）检测小鼠肝组织中纤维相关因子α-SMA和Ⅰ型胶原（COL-Ⅰ）mRNA表达水平。结果:与空白对照组比较,8周后模型对照组和LMWH治疗组小鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL和HA水平明显升高,肝组织胶原纤维沉积增多,肝组织α-SMA表达增多,α-SMA 和COL-ⅠmRNA表达水平显著升高（均P＜0.05）。与模型对照组比较,8周后LMWH治疗组小鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL和HA水平降低,肝组织胶原纤维沉积减少,肝组织α-SMA表达减少,肝组织α-SMA 和COL-ⅠmRNA表达降低（均P＜0.05）。结论:LMWH可抑制CCl4诱导的小鼠肝脏损害及纤维化,其机制可能与LMWH的抗凝作用有关。     

白藜芦醇抑制大肠埃希菌O104∶H4诱导的结肠上皮细胞NLRP3炎症小体活化

目的：研究白藜芦醇（RES）对大肠埃希菌O104∶H4感染的结肠上皮Caco-2细胞线粒体和氧化应激损伤及NLRP3炎症小体活化的影响。方法：RES（200 μmol/L）预处理Caco-2细胞12 h,然后107 CFU/mL的大肠埃希菌O104∶H4（MOI 10∶1）感染细胞4 h。CCK-8法检测细胞活力,qRT-PCR法分析过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC1α）、细胞色素氧化酶4（COX-4）、核呼吸因子1（NRF1）、线粒体转录因子1（TFAM）、超氧化物歧化酶1（SOD1）和血红素加氧酶1（HO-1）mRNA表达水平,Western blot检测炎症小体NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1活化亚基p20（CASP1 p20）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1活化亚基p10（CASP1 p10）、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达水平,并对Caco-2细胞线粒体膜电位、氧耗量和活性氧（ROS）水平进行检测。结果：大肠埃希菌O104∶H4感染可明显诱导NLRP3、CASP1 p20、CASP1 p10、IL-1β蛋白和PGC1α、COX-4和NRF1 mRNA表达,促使氧消耗量和ROS水平增高,而细胞活力、TFAM mRNA表达和线粒体膜电位降低（P<0.05）;RES处理后能明显抑制NLRP3、CASP1 p20、CASP1 p10、IL-1β蛋白和PGC1α、COX-4和NRF1 mRNA表达,降低氧消耗量和ROS水平,而细胞活力、TFAM mRNA表达和线粒体膜电位增高（P<0.05）;另外,ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）也能显著抑制NLRP3炎症小体和IL-1β表达水平。 结论：大肠埃希菌O104∶H4感染诱导Caco-2细胞线粒体释放ROS和NLRP3炎症小体活化,而RES可部分改善Caco-2细胞损伤,降低NLRP3炎症小体和ROS水平。     

当归多糖对DPN大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路抑制影响

目的: 分析当归多糖对糖尿病神经病变（DPN）大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路抑制影响。方法: 选取SPF级Wistar雄性大鼠105只,随机选取15只作为正常组,剩余90只大鼠制备DPN模型,成功造模75只,随机分成5组,模型组、当归多糖低、中、高剂量组和阳性对照组,每组15只。模型组和正常组大鼠采用2 mL/100 g生理盐水灌胃,当归多糖低、中、高剂量组大鼠给予当归多糖药液灌胃,阳性对照组给予弥可保+二甲双胍溶液灌胃,每日给药体积均为2 mL/100 g。每天1次,连续灌胃10 d。给药3、10 d后检测大鼠机械缩足反应阈值（PWT）、热缩足反射潜伏期（PWL）,末次给药后检测大鼠空腹血糖、血清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、白细胞介素-6（IL-6）、髓鞘碱性蛋白（MBP）、TNF-α及C反应蛋白（CRP）含量,检测大鼠运动神经传导速度（MNCV）、感觉神经传导速度（SNCV）,大鼠坐骨神经内核因子-κB（NF-κB） mRNA、髓样分子因子88（MyD88） mRNA及Toll样受体4（TLR4） mRNA表达。结果: 模型组及当归多糖低剂量组大鼠空腹血糖、MDA含量显著高于正常组,CAT、SOD及GSH-Px含量显著低于正常组,当归多糖中、高剂量组大鼠空腹血糖、MDA含量显著低于模型组、阳性对照组,CAT、SOD及GSH-Px含量显著高于模型组、阳性对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;模型组、当归多糖低剂量组大鼠血清IL-6、MBP、TNF-α及CRP含量均显著高于正常组,当归多糖中、高剂量组大鼠血清IL-6、MBP、TNF-α及CRP含量均显著低于模型组、阳性对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;模型组、当归多糖低剂量组大鼠NF-κB mRNA、MyD88 mRNA及TLR4 mRNA表达量均显著高于正常组,当归多糖中、高剂量组大鼠NF-κB mRNA、MyD88 mRNA及TLR4 mRNA表达量均显著低于模型组、阳性对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论: 当归多糖可显著改善DPN大鼠的周围神经损伤状态,促进神经传导的恢复,其机制可能与阻断TLR4/MyD88/NF-κB信号路径的转导,降低炎性因子水平,减轻神经的氧化应激损伤有关。     

细胞焦亡在肠缺血再灌注损伤中作用的研究进展

细胞焦亡是一种可导致炎症反应的程序性细胞死亡，其发生依赖于炎症小体、炎性半胱天冬酶（caspase）等蛋白相继激活进而裂解消皮素D（gasdermin D, GSDMD）蛋白使其N端在细胞膜多聚化并产生焦亡小孔。细胞焦亡的发生有炎症小体激活caspase-1的经典途径和胞质LPS激活caspase-4/5/11的非经典途径；作为介导机体炎症反应的重要机制，细胞焦亡在机体应对伤害性刺激的反应中具有不可替代的作用，其与神经系统疾病、心血管系统疾病和肿瘤等多种疾病密切相关。最近研究发现，细胞焦亡在肠缺血再灌注损伤（intestinal ischemia-reperfusion injury, II/RI）的发生中也具有关键作用，本文就近年来细胞焦亡的分子特征、机制与II/RI的关系进行综述，旨在为II/RI的防治提供理论依据。     

氟非尼酮对二乙基亚硝胺诱导的肝损伤大鼠肝细胞中TGF-β1/Smads通路的抑制作用

目的：探究氟非尼酮（fluorofenidone, AKF-PD）对二乙基亚硝胺所致大鼠肝损伤的保护作用及对肝细胞中TGF-β1/Smads通路的影响。方法：55只雄性Sprague Dawley（SD）大鼠随机分为3组：模型组（DEN组,n=20）,灌胃给予10 mg/kg DEN,每周5次至14周停药;对照组（Control组,n=20）,灌胃给与同模型组等体积的生理盐水;治疗组（DEN+AKF-PD组,n=15）,在造模4周后,灌胃给与500 mg/kg AKF-PD,每天一次,至14周停药。实验结束后,麻醉,脊椎脱臼法处死大鼠。肝脏组织进行Masson染色以观察胶原沉积;提取并鉴定原代肝细胞,测定肝细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、Smad3、Smad7 mRNA的水平,以及Smad3、Smad7蛋白质的表达。结果：与对照组相比,Masson染色显示DEN组中大鼠肝组织胶原纤维明显增多,而AKF-PD治疗可有效减轻肝损伤和纤维化程度。此外,与DEN组相比,AKF-PD治疗组中α-SMA、TGF-β1、Smad3 mRNA水平明显降低,Smad7 mRNA水平升高,AKF-PD治疗也可在一定程度上降低Smad3蛋白的表达,增加Smad7蛋白的表达。 结论：AKF-PD可显著改善DEN所致大鼠肝损伤和纤维化,该作用可能与AKF-PD下调肝细胞中α-SMA、TGF-β1、Smad3 mRNA水平,增加Smad7 mRNA水平相关。     

NADPH氧化酶NOX4抑制剂调节肝癌相关成纤维细胞的形成和机制研究

目的：研究NADPH氧化酶（NOX4）抑制剂GLX351322抑制肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）形成的作用和机制。方法：小鼠成纤维细胞NIH3T3和肝癌H22共培养,5 μmol/L（IC50）的GLX351322进行NIH3T3预处理。CCK-8法检测成纤维细胞的活力,PI染色后流式细胞术检测细胞周期的改变,免疫荧光染色检测CAFs标志物α-SMA和FAP的表达,蛋白免疫印迹（Western blot）法检测CAFs标志物α-SMA、Desmin、FAP、TSP-1、FSP、CyclinD的表达水平以及TGF-β1、Smad1的表达。H22构建荷瘤小鼠模型后,GLX351322处理,免疫组织化学染色检测肿瘤组织中α-SMA的表达情况以及CAFs标志物的表达水平。结果：GLX351322预处理后可以抑制NIH3T3的增殖,细胞活力下调,周期改变。同时可以下调CAFs标志物α-SMA、Desmin、FAP、TSP-1、FSP、CyclinD的表达,且TGF-β信号受到抑制。而在荷瘤小鼠模型中,GLX351322也可以显著抑制α-SMA的表达以及CAFs标志物的表达水平。结论：NOX4抑制剂GLX351322可以抑制肿瘤相关成纤维细胞的形成,其作用和TGF-β信号抑制有关。     

热休克转录因子2通过HMGB1-TLR4-NF-κB信号促进克罗恩病炎症反应的作用机制研究

目的:研究热休克转录因子2（HSF2）通过HMGB1-TLR4-NF-κB信号促进小鼠克罗恩病炎症反应的作用机制。方法:2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）构建小鼠克罗恩病模型,将小鼠分为正常组,模型组,对照组,实验组。对照组采用高迁移率族蛋白1（HMGB1）抗体处理阻断HMGB1信号,对照组和实验组均采用重组HSF2干预。观察小鼠一般生活状况（包括：生存状态、体质量状态、大便性状、进食饮水状态、毛发光泽度、精神状态和活动状态）,小鼠疾病活动指数（DAI）评估小鼠疾病情况,苏木精-伊红（HE）染色检测小鼠肠组织病理改变,免疫组织化学染色（IHC）检测小鼠肠组织中p-65的表达,酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠结肠组织中炎症因子白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）的水平,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测结肠组织中HMGB1、Toll样受体4（TLR4）、NF-κB（p-P65)、髓样分化因子（MyD88）的表达水平。结果:TNBS成功诱导小鼠克罗恩病,实验组小鼠一般生活状态较差,且DAI评分显著高于对照组、模型组,具有统计学意义（P<0.05）。HE染色显示实验组小鼠结肠黏膜糜烂、水肿、炎症反应程度高于模型组和对照组。实验组小鼠结肠组织中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6的水平显著高于模型组和对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。实验组组织中HMGB1、TLR4、NF-κB（p-P65)、MyD88的表达水平显著高于模型组和对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:HSF2可以通过激活HMGB1-TLR4-NF-κB信号促进小鼠克罗恩病炎症反应。