应用内源前体策略提高杆菌发酵制备TTMP的能力

基于前体乙偶姻和四甲基吡嗪(TTMP)分子结构的相关性,建立了一种适合于风味化合物TTMP筛选的内源前体筛选策略;并应用该策略,从酱香型高温大曲中获得1株TTMP产生菌XZ1124,该菌株能利用葡萄糖代谢产生大量前体乙偶姻,从而有效促进了TTMP的合成;根据菌落、细胞形态特征和生理生化特性以及16S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为枯草杆菌(Bacillus subtilis).碳氮源以及培养条件的单因素优化结果表明,供氧条件和培养温度对TTMP合成的影响最为突出.在最优条件下,摇瓶发酵和发酵罐培养时前体乙偶姻的积累量＞ 20 g/L,TTMP的合成量＞ 4.08 g/L.上述结果有效证明了内源前体筛选策略用于筛选具有结构类似前体的风味功能菌;TTMP合成工艺具有生产强度高且能以廉价的农副产品(豆饼粉)作为底物,极具工业应用前景.     

2,3-丁二醇调控四甲基吡嗪及乙偶姻合成菌产物产量的研究

发酵初期在枯草芽孢杆菌发酵培养基中添加2,3-丁二醇(2,3-BD)可以调控发酵产物乙偶姻,四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TTMP)的产量。随着2,3-BD添加量的增加,所产乙偶姻和TTMP的量随之增加,当2,3-BD的添加量≥4.0 g/L时,乙偶姻和TTMP的产量不再增加。同时,枯草芽孢杆菌的生物量、糖转化率也随之变化。该调控方法对枯草芽孢杆菌的分子改造菌株(Δbdh A)调控产乙偶姻和TTMP的产量影响不大。     

Paenibacillus polymyxaZJ-9混合发酵菊粉和葡萄糖合成R,R-2,3-丁二醇

在7.5 L发酵罐上考察了Paenibacillus polymyxa ZJ-9混合发酵菊粉和葡萄糖合成R,R-2,3-丁二醇的工艺条件。选用菊芋菊粉粗提液为发酵前期底物,分析比较不同初始菊粉浓度下的细胞比生长速率(μ)和产物比合成速率(qp),进而研究了补糖种类和不同补料方式对合成R,R-2,3-丁二醇的影响。结果表明,初始菊粉75.0g/L,当发酵到24 h、31 h时,分别添加15.0 g/L的葡萄糖,发酵效果最佳,44 h时,产物产量达到最高值47.8 g/L,与分批发酵相比,糖转化率由原来的34.9%提高到45.5%,生产强度由原来的0.70 g/(L·h)提高到1.09 g/(L·h),并且副产物乙偶姻、残糖浓度相对较低。     

辅助能量物质柠檬酸促进ε-聚赖氨酸的合成

为提高ε-聚赖氨酸(ε-PL)合成能力,考察了柠檬酸对Streptomyces sp.M-Z18菌体生长和ε-PL合成的影响。研究发现,柠檬酸作为辅助能量物质,对ε-PL发酵过程影响显著。通过对柠檬酸添加时间、添加量和pH值的优化,确定了最佳柠檬酸添加方式,结合补料-分批发酵工艺,显著提高了ε-PL的产量。实验结果表明,在5L发酵罐中,维持pH为3.8,初始柠檬酸添加量为20 g/L时,分批发酵ε-PL的产量达到9.50 g/L,产率达到4.40 g/(L.d),较未添加柠檬酸发酵分别提高了46.4%和48.1%。采用添加柠檬酸的补料-分批发酵工艺,发酵168 h后ε-PL的产量达到22.89 g/L,是分批发酵的2.41倍。     

代谢工程改造大肠杆菌合成β-丙氨酸

β-丙氨酸是天然存在的唯一一种β型氨基酸,在医药、食品、化工等领域有重要应用。该研究考察了以重组Escherichia coli发酵合成β-丙氨酸的可能性。在敲除副产物乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸合成途径编码基因的Escherichia coli CICIM B0016-050(ack A-pta pfl B adh E frd A ldh A)菌株中,考察叠加敲除β-丙氨酸的竞争途径天冬氨酸激酶、泛酸合成酶和葡萄糖转运蛋白(EⅡCBGlc)的编码基因(lys C、pan C、pts G)以及过表达来源于Corynebacterium glutamicum的pan D基因对合成β-丙氨酸的影响。结果表明,叠加敲除上述基因后,β-丙氨酸的合成量依次提高了12.5%、39.3%和13.3%;过量表达pan D基因,β-丙氨酸合成量提高了86.2倍;经发酵条件优化,菌株B0016-080BB/p PL-pan D摇瓶发酵可合成(5.0±0.2)g/Lβ-丙氨酸,体积生产强度达到(0.12±0.01)g/(L·h)。该结果为发酵法合成β-丙氨酸奠定了基础。     

Candida etchellsii产2(5)-乙基-4-羟基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮的影响因素

在埃切假丝酵母(Candida etchellsii)发酵过程中,通过盐度调控和氨基酸添加,强化目标产物HEMF(2(5)-乙基-4-羟基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮)的合成效率。分阶段调控发酵体系的盐度(初始阶段控制CaCl浓度为200 g/L,发酵40 h后提升至220 g/L),结合氨基酸添加(向发酵体系中添加丙氨酸、精氨酸和甘氨酸各1.67 g/L)。摇瓶结果表明:酵母C.etchellsii合成HEMF,其产量为110.74 mg/L。7 L发酵罐上罐验证,HEMF产量达到121.51 mg/L,相比空白(200 g/L CaCl浓度下且没有添加氨基酸)提高了21.2倍。分阶段盐度调控结合氨基酸添加策略显著强化了C.etchellsii对HEMF的合成。     

甘油耐受菌Klebsiella pneumoniae XJPD-Li合成1，3-丙二醇的研究

利用自行筛选的1,3-丙二醇(1,3-PD)合成菌株Klebsiella pneumoniae XJPD-Li进行发酵,考察了甘油浓度对菌株生长及合成1,3-PD的影响。经多次甘油耐受后菌株XJPD-Li在摇瓶培养48 h,菌体生物量(OD_(650))和1,3-PD产量分别达到1.52和11.16 g/L,相比耐受前分别提高48%和159%。在5 L发酵罐批式培养中,甘油耐受后XJPD-Li菌体生物量并未显著增长,但合成1,3-PD的能力却提高了77%,达到53.13 g/L。     

发酵后期补加2种氮源对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影响

为探寻解决重要平台化合物1,3-丙二醇发酵后期菌体生长和1,3-丙二醇合成受限的方法,通过从菌体量、产物和关键酶活性及基因转录水平等方面,较全面地考察了发酵后期补加酵母膏和硫酸铵对克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)合成1,3-丙二醇的影响,结果为:添加两种氮源均有利于菌体生长;补加10 g/L酵母膏和硫酸铵,1,3-丙二醇产量由58.6 g/L分别提高到70.6 g/L和77.2 g/L;相对于酵母膏,硫酸铵对关键酶活性的增强更为明显,并使甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase,Dha D)在发酵后期始终维持较高水平,促进细胞生长和产物合成。此外,与补加酵母膏相比,补加硫酸铵后关键酶基因转录水平上调并不显著。表明硫酸铵主要通过直接激活关键酶活性促进细胞生长和产物合成。综上所述,发酵后期补加硫酸铵更利于1,3-丙二醇的生物合成,是提高发酵合成1,3-丙二醇水平的有效方式之一。     

碱性过氧化氢预处理后汽爆玉米秸秆半同步糖化发酵生产乙醇

为了实现纤维素乙醇生产的"三高"(高浓度、高转化率和高发酵效率)指标,以复合预处理处理后的玉米秸秆为基质,探究其半同步糖化发酵工艺过程。通过对其高底物浓度预酶解过程特性考察,确定其最佳预酶解工艺为:在加酶量30 FPU/g干基质和50℃下,以15.6%(w/v)为起始基质浓度,在酶解12 h时补加相当于20%(w/v)初始基质浓度的干物料后继续酶解24 h。在最佳预酶解工艺基础上,探究了培养基成分和培养条件对乙醇发酵的影响,确定了发酵过程工艺:酵母提取物16 g/L、接种龄20 h、接种量0.6 g干菌体/L、发酵温度39℃和PEG4000 0.01 g/g干基质。在最佳的半同糖化发酵工艺下,发酵24 h后,乙醇产量达73.75 g/L,发酵效率为3.07 g/(L·h),转化率为61%。结果表明通过补料半同步糖化发酵过程可以实现高浓度和高发酵效率双重目标,这有利于推进纤维素乙醇生产的工业化发展。     

两阶段溶氧控制及FeSO_4添加对谷氨酸棒杆菌合成4-羟基异亮氨酸的影响

优化4-羟基异亮氨酸发酵过程中溶氧水平及FeSO_4添加量,以提高其发酵水平。结合菌株Corynebacterium glutamicum HIL18及4-羟基异亮氨酸合成特点,首先考察不同溶氧水平及两阶段溶氧控制对4-羟基异亮氨酸发酵的影响。然后考察FeSO_4添加对其发酵的作用。20%溶氧有利于4-羟基异亮氨酸的合成。利用两阶段溶氧控制工艺(0～20 h、20%溶氧;20～64 h、30%溶氧)经64 h发酵,4-羟基异亮氨酸产量达到38.7 g/L,较未使用该工艺提高11.2%。采用两阶段FeSO_4添加策略(初始浓度为65μmol/L、20 h添加30μmol/L),4-羟基异亮氨酸的产量达到43.4 g/L。采用优化后的工艺使得4-羟基异亮氨酸产量较优化前提高27.3%。获得了4-羟基异亮氨酸发酵过程中两阶段溶氧控制及FeSO_4添加工艺。该结果为4-羟基异亮氨酸的高效发酵合成提供参考。     

白酒细菌酒曲固态培养条件下B.subtilis S12产四甲基吡嗪的合成机制

四甲基吡嗪又名川芎嗪,是白酒中重要的风味成分,但其在白酒酿造过程的形成机制尚不明晰。为了探索白酒固态酿造体系中四甲基吡嗪的合成机制,作者从白酒细菌曲中分离得到一株产四甲基吡嗪菌株B.subtilis S12,并对细菌曲固态培养条件下四甲基吡嗪的合成机制进行了探究。结果表明:固态条件下B.subtilis S12合成四甲基吡嗪分两步来进行:第一步,在全细胞催化下细菌利用底物合成四甲基吡嗪的前提物质3-羟基丁酮,同时氨基酸残基在氨基酸脱氢酶作用下生成氨;第二步,3-羟基丁酮和氨在热动力作用下生成四甲基吡嗪。     

Tetramethylpyrazine in Chinese sesame flavour liquor and changes during the production process

Tetramethylpyrazine (TTMP) is a key bioactive alkaloid and flavour compound found in Chinese sesame flavour liquor. Changes in TTMP concentration during the production of sesame flavour liquor have received little attention. Here, TTMP was tracked from raw material, fermented grains and fresh liquor in storage using high‐performance liquid chromatographic–tandem mass spectrometry (HPLC‐MS/MS). The results showed that TTMP was formed during stack fermentation, solid‐state fermentation and distillation, while no TTMP was produced during the storage process of fresh liquor. Furthermore, a higher temperature fermentation and bacterial starter culture were beneficial to TTMP generation. Accordingly, technology strategies for increasing the concentration of TTMP in sesame flavour liquor include raising the temperature of stack fermentation and distillation, reducing the distillation speed and screening for high TTMP producing Bacillus species. © 2018 The Institute of Brewing & Distilling     

高温大曲中高产四甲基吡嗪芽孢杆菌的分离鉴定及发酵条件优化

该研究从高温大曲中分离筛选产四甲基吡嗪（TTMP）芽孢杆菌,采用细胞形态学观察、生理生化试验及分子生物学技术对高产四甲基吡嗪菌株进行鉴定,并优化四甲基吡嗪产量最高菌株的发酵条件。结果表明,经初筛从高温大曲中分离出20株产四甲基吡嗪芽孢杆菌（编号为WH1～WH20）,经过复筛得到四甲基吡嗪产量较高的菌株WH7、WH10和WH20。其中菌株WH7和WH20被鉴定为副淀粉芽孢杆菌（Bacillus paramycoides）,菌株WH10被鉴定贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。菌株WH10的最佳发酵条件为：前发酵温度37℃、前发酵时间72 h,后发酵温度60℃,后发酵时间20 h,初始pH值6.5,铵盐添加量4 g/L。在此优化条件下,四甲基吡嗪产量为728.38 mg/L,比优化前提高了167%。     

可同化氮源磷酸氢二铵对发酵型猕猴桃酒品质的影响

为考察可同化氮源磷酸氢二铵（diammonium phosphate,DAP）对发酵型猕猴桃酒品质的影响,向猕猴桃汁中添加100～400 mg/L（氮质量计,下同）的DAP,并对发酵所得猕猴桃酒的基本理化指标、潜在有害醇类物质、营养组分和香气物质进行检测与分析。结果表明：添加100～400 mg/L的DAP均可以加快起酵后48 h内的乙醇发酵速度,并显著降低了猕猴桃酒中高级醇和甲醇等潜在有害醇类物质产量。特别是添加300 mg/L的DAP时,猕猴桃酒的总高级醇和甲醇产量分别下降了42.84%和20.1%;尽管添加DAP显著降低了酒中的氨基酸总量,但却对猕猴桃酒中的VC和总酚含量没有显著影响;添加DAP显著增加了猕猴桃酒的乙酸酯类和乙酯类香气物质含量,其中,添加300 mg/L的DAP可以显著增加乙酸乙酯、正己酸乙酯、正辛醛、庚醇和1-辛烯-3-醇等香气物质含量,从而使猕猴桃酒果香和花香较为浓郁。因此,添加适量的可同化氮源DAP可以提升发酵型猕猴桃酒的品质。     

二羟丙酮羰氨反应体系中烷基吡嗪生成规律的研究

烷基吡嗪(APZ)是食品的重要风味成分组分,同时也是羰氨反应(美拉德反应)的产物之一。为了探究羰氨反应体系中新的APZ反应模型及模型中烷基吡嗪生成的规律,本文以铵盐与二羟丙酮为底物,研究了铵盐种类、时间、温度、浓度、比例及pH对二羟丙酮产生不同烷基吡嗪化合物(Alkylpyrazine,APZ)的影响规律。以反应APZ生成量为标准,在五种铵盐中,氯化铵与二羟丙酮反应生成APZ含量最高,为(4.59±0.11) mg/L;最适反应时间为15 h,反应浓度为3.7 mol/L,反应比例为1∶1,反应pH为3。以氯化铵与二羟丙酮为反应底物,APZ生成量随着温度的升高而升高;随着反应时间的延长,APZ生成量先上升再下降,其中,2,3,5-三甲基吡嗪与四甲基吡嗪的生成遵循零级反应规律;随着反应浓度的增大,APZ生成量呈现先上升后下降的趋势,固定二羟丙酮浓度,随着氯化铵浓度比例的增高,APZ含量也呈现先升后降的趋势;在弱酸性的环境下,更有利于APZ的生成。     

苹果酒发酵过程中酵母营养的研究

苹果汁发酵常出现发酵迟滞或停滞的现象，影响苹果汁发酵迟滞或停滞的主要原因是酵母的营养问题，即可同化氮源和维生素。为此，本文通过单因素试验研究了磷酸氢二铵（DAP）、硫酸铵、硫胺素、肌醇、烟酰胺、吡哆醇、生物素、泛酸等八种营养素对发酵的影响。结果表明，磷酸氢二铵（DAP）、硫酸铵、硫胺素及生物素的添加都对酵母代谢有显著影响，当添加量分别为400、1200、0．30及0．20mg／L时，酒精度达到最大值，酵母代谢最为旺盛。     

发酵食品中四甲基吡嗪的检测、来源及其微生物合成途径研究进展

四甲基吡嗪（TTMP）是中药川穹的有效成分,属吡嗪类生物碱,具有抑制血小板聚集和血栓形成、扩张小动脉、改善微循环和脑血流的作用。发酵食品中的TTMP主要是由美拉德反应和微生物代谢产生,TTMP是发酵食品的健康功能成分之一。该综述重点介绍了发酵食品中TTMP的检测方法、高产TTMP菌种及其生物合成途径,提出发酵食品中TTMP的增产策略,为深入研究TTMP的生物合成路径和TTMP高产菌株应用技术提供重要的理论依据。     

Fire performance and decay resistance of solid wood and plywood treated with quaternary ammonia compounds and common fire retardants

In this study, the fire performance and decay resistance of solid wood and plywood treated with quaternary ammonia compounds (didecyl dimethyl ammonium chloride (DDAC) and didecyl dimethyl ammonium tetrafluoroborate (DBF)) were compared with the performance of untreated control specimens and specimens treated with common fire retardants ((monoammonium phosphate (MAP), diammonium phosphate (DAP) and ammonium sulphate (AS)). Test specimens were treated with 1% and 4% (% m/v) aqueous solutions of the chemicals. The fire performance tests were the fire tube test (ASTM E 69) which measures mass losses in the specimens and the cone calorimeter test (ASTM E 1354) which measures mass loss, heat release rate, time for sustained ignition, effective heat of combustion, and specific extinction area. The results from the cone calorimeter tests were used to estimate the flame spread index (FSI) in the Steiner tunnel test (ASTM E 84). Heat release rates of the specimens treated with MAP, DAP, and AS were lower than those of both DDAC and DBF-treated specimens and the untreated control specimens. Compared with the untreated specimens, higher heat release rates were observed for the specimens treated with the quaternary ammonia compounds, DDAC and DBF. The estimates for the FSI for DDAC and DBF were for values equal to or higher than for the untreated control specimens. At higher concentration levels, MAP, DAP and AS were effective in decreasing initial contribution of heat release to potential fire. Decay resistance tests were done according to AWPA E 10 standard method using one brown-rot fungus and one white rot-fungus. Decay resistance tests revealed that solid wood specimens treated with DDAC and DBF showed resistance against the fungi tested, however, MAP, DAP and AS did not provide complete protection. While DBF and DDAC increased resistance of plywood specimens, high mass losses in plywood specimens treated with MAP, DAP and AS were obtained.     

发酵过程中添加磷酸氢二铵对苹果酒香气物质的影响

以富士苹果为原料,分别在发酵前、酵母生长对数期和稳定期前期添加280 mg/L的磷酸氢二铵（DAP）,研究DAP的添加对酵母发酵性能和苹果酒香气物质的影响。结果表明,发酵过程中添加DAP可加快酵母发酵速率,在酵母发酵前和酵母生长对数期添加DAP显著降低了琥珀酸含量（P＜0.05）;在稳定期前期添加DAP显著降低了苹果酸含量（P＜0.05）,总香气含量最高（11.09 mg/L）,更有利于苹果酒中挥发性香气化合物的合成,但对酵母数影响不大。     

响应面法优化枯草芽孢杆菌S0507产四甲基吡嗪的培养条件

通过响应面分析法对枯草芽孢杆菌S0507产四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine,TTMP）培养工艺进行优化。经单因素试验后,以Box-Behnken法设计考察培养时间、培养温度、水分含量3 个因素对TTMP产量的交互影响,用Design-Expert v8.0.1.6软件对BBD试验数据进行分析处理。通过响应面试验得到的最佳培养条件为：低温培养时间33.84 h、培养温度41.75 ℃、水分含量59.63%,TTMP产量为332.70 mg/kg,理论值（335.49 mg/kg）与实验值的相对偏差为0.84%,证明应用响应曲面法优化枯草芽孢杆菌S0507产TTMP的培养条件是可行的。