恶臭假单胞菌透性化细胞海藻糖合酶的酶反应工艺及其特性研究

用甲苯对恶臭假单胞菌细胞进行透性处理,研究了透性化细胞海藻糖合酶的酶反应工艺及其特性。研究结果表明,该细胞酶的最适反应条件为pH7.8,转速180 r/min,温度为40℃,反应时间为8 h。透性化细胞海藻糖合酶具有极强的底物特异性,激活离子有Na+、K+,重金属离子强烈抑制菌体生长和酶活。     

硝基还原假单胞菌谷氨酰胺酶的分离纯化及酶学性质

采用离子交换层析和凝胶过滤层析等方法,分离纯化硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)SK16.004所产的谷氨酰胺酶,并进一步研究该酶的酶学性质及反应动力学参数。结果表明,该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为9.0,温度稳定范围为37～60℃,pH稳定范围为5.0～11.0;Cu2+对促进酶活提高作用最大,而Fe3+会抑制该酶的转移活力。谷氨酰胺酶对底物谷氨酰胺的亲和力最强,其Km值为0.72 mmol/L,Vmax为0.55μmol/(min.mL)。     

水生栖热菌FL-03海藻糖合酶基因克隆及原核表达

海藻糖合酶(Trehalose synthase,TreS)属于α-淀粉酶家族(α-amylase family),是生物体内通过TreS途径生成海藻糖的一种酶类。利用PCR技术,从水生栖热菌FL-03菌株FL-03中扩增了海藻糖合酶基因(TresC01),将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),得到重组质粒P-TresC01,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,重组蛋白经SDS-PAGE分析,得到一条分子量约为110ku的特异条带,并经Western blotting分析鉴定,表明成功构建重组质粒P-TresC01并在大肠杆菌中表达,为进一步的研究奠定基础。     

Paenibacillus puldeungensis LK18普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质研究

本研究根据类芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的保守区设计兼并引物,从Paenibacillus puldeungensis LK18中扩增出普鲁兰酶基因(pul A),将其连接至p ET-28a(+)载体上,构建出重组表达载体p ET-28a(+)-pul A,转入到EscherichiacoliBL21(DE3)中,成功地表达了重组普鲁兰酶。结果表明:该普鲁兰酶基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过Ni柱亲和层析纯化出重组蛋白,测定其比酶活为508.8 U/mg,分子量约为76.95 ku。该重组酶的最适反应温度为45℃,在35℃～40℃下保温120 min后剩余酶活达60%以上;最适作用p H为6.0,在p H 6.0～8.0条件具有较好的稳定性;10 mmol/L的K+和Mg~(2+)对该重组普鲁兰酶有激活作用,而Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)等对其有不同程度的抑制作用。本研究成功地构建出一株可高效表达普鲁兰酶的重组菌株,具备一定的工业应用价值。     

一株产海藻糖合酶假单胞菌菌株的分离及鉴定

由薄层层析法检测试验发现,从昆明磷矿粉中分离出的一株真细菌,其粗酶液能将麦芽糖异构化为海藻糖。通过显微观察发现,该菌株为革兰氏阴性菌,无色、杆状、具有鞭毛;菌体直径大小0.6～0.8 μm,长度约1.4～2.0 μm;胞内没有聚-β-羟丁酸（PHB）包含体;最佳生长温度为30 ℃,最适生长pH为7.0。经16S rRNA序列比对、DNA（G+C）mol%和DNA-DNA杂交等分子生物学技术以及生理生化特性检测后,认定该菌株为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）一种,将其命名为BIE-1。该菌株增加了假单胞菌属菌种多样性,为海藻糖生物合成真细菌菌株提供了新的选择。     

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶基因的原核表达

采用降落聚合酶链式反应（touchdown polymerase chain reaction,TD-PCR）技术,从2-酮基葡萄糖酸工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01中克隆了编码2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的基因kguE。将目的基因与质粒pET-28a（＋）重组后转入宿主表达菌中,获得了重组菌株大肠杆菌BL21（DE3）/pET-28a（＋）-kguE。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导下,该重组菌株表达了一个分子质量约为30.5?ku的融合蛋白,且该蛋白的Western-blot鉴定结果显示为阳性。生物信息学分析结果表明,该蛋白是一种由256?个氨基酸残基组成的分子质量为28.5?ku的亲水性蛋白,与恶臭假单胞菌的2-酮基葡萄糖酸差向异构酶在氨基酸序列上的一致性达78%,定位于细胞质中,其二级结构中α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为40.62%、17.19%和42.19%。本研究结果为变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的功能研究提供了一定理论支持。     

产海藻糖合酶菌株发酵培养基的研究

在已筛选出产海藻糖合酶菌株———恶臭假单胞杆菌的基础上 ,研究了该菌株最佳发酵培养基。恶臭假单胞杆菌H76的最适碳源为麦芽糖和葡萄糖 ,最适氮源为蛋白胨和酵母粉 ,无机盐为MgSO4 ·7H2 O ;该菌株产酶最佳培养基配方为 :麦芽糖 3 % ,葡萄糖 3 % ,Mg SO4 7H2 O 0 2 % ,蛋白胨 2 % ,酵母粉 0 7%。     

耐热嗜碱蛋白酶基因的克隆、表达及其酶学性质分析

碱性蛋白酶是一类重要的工业酶制剂。为进一步提高碱性蛋白酶在高温碱性条件下的活力,增强其工业应用价值,本文从地衣芽胞杆菌CCTCC M2018539中首先通过PCR扩增获得碱性蛋白酶编码基因aprE539并克隆入表达载体pND-113中,在枯草芽胞杆菌WB600中实现碱性蛋白酶AprE539的表达;重组酶AprE539经硫酸铵沉降(30%~70%)、透析、DEAE阴离子交换和超滤获得纯酶,并以SDS-PAGE电泳测定AprE539的分子量大小。结果表明,AprE539的分子量大小为30 kDa。进一步对其酶学性质研究表明:AprE539的最适作用pH为11.0,最适作用温度为65~70℃;在pH6.0~12.0范围内具有较好的稳定性;在60℃保温1 h后酶活剩余70%;Cu²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺对酶活有明显促进作用。AprE539在氨基酸序列上仅有2个氨基酸残基与碱性蛋白酶2709存在差异,但其酶学特征差异明显,为后续进一步探究其酶学性质差异性奠定基础。     

大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质

以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶(mdh),纯化后比酶活达到112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0~6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Cu2+对酶有抑制作用,Hg2+和Zn2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47μmol/(L.min)。     

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆、表达及生物信息学分析

采用聚合酶链式反应技术,从2-酮基葡萄糖酸工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01中克隆2-酮基葡萄糖酸激酶的全长基因kguK,并在此基础上构建了重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-kguK。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导下,该重组菌株表达了一个特异的分子质量约为36.0 ku融合蛋白,且该蛋白的Western-Blot鉴定结果显示为阳性。生物信息学分析结果表明,该蛋白是一种由305个氨基酸残基组成的亲水性蛋白,定位于细胞质中,存在着与pfkB家族蛋白类似的保守结构域,其二级结构中α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为35.73%、12.79%和51.48%。     

海藻德合酶基因工程菌诱导表达条件的研究

实验将构建后的重组质粒pET21TreS转入大肠杆菌Rosetta gami(DE3)中,得到海藻糖合酶基因工程菌,并通过对培养时间、温度及诱导剂浓度等条件的优化,对其进行诱导表达,得到了该基因工程菌诱导表达的最适条件:发酵培养至菌体浓度(OD_(600))至0.6～0.8时,以1mmol/L浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTC),37℃,诱导2h后得到的蛋白表达量较高.     

黑曲霉木聚糖酶（xynZF-2）基因克隆、表达及酶学性质分析

利用RT-PCR技术从黑曲霉（Aspergillusniger）XZ-3S中成功克隆出木聚糖酶基因（xynZF-2）的cDNA序列（Genbank登录号为：JQ700382）。该基因核苷酸序列阅读框全长678bp,编码225个氨基酸,其中成熟肽为107个氨基酸。以重组质粒pUCm-T—xynZF-2为模板,扩增得到编码xynZF－2成熟肽的cDNA片段（624bp）。将其与表达载体pET－28a连接,构建重组表达载体pET－28a—xynZF－2,并转化大肠杆菌（Escherichiacoh）BL21（DE3）,获得重组工程菌BL21／xynZF-2。经IPTG诱导表达,木聚糖酶的的比酶活最高可达42．33U／mg。重组表达的木聚糖酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为5．0,在碱性条件下具有良好的稳定性。Fe^3＋对酶的激活作用最为明显。     

水生栖热菌海藻糖合成酶基因的克隆及真核表达

通过基因工程技术合成海藻糖合酶Tres 全基因,插入到毕赤酵母菌表达载体pPICZα中。电转化毕赤酵母菌GS115 后,经Zeocin 抗性筛选阳性菌株。用PCR 和全基因测序鉴定目的基因的表达。通过诱导表达目的蛋白,并以SDS-PAGE 和Western blotting 进行鉴定。成功地构建了pPICZα-Tres 重组质粒,并证明目的基因已整合于毕赤酵母菌的基因组。     

超嗜热细菌Thermotoga maritima酯酶Tm1350克隆、表达及其酶学性质研究

以超嗜热细菌Thermotoga maritima基因组DNA为模板,通过PCR法扩增酯酶Tm1350基因,构建重组质粒p ET15b-Tm1350,在大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）中实现表达,并采用p-NPA方法测定其酶活性。研究结果表明,酯酶Tm1350可以水解不同碳链长度（10C）的对硝基苯酚酯,其中对硝基苯酚戊酸酯（p NP-C5）是该酶最适合底物;该酶最适反应温度和p H分别为70℃和6.5,90℃处理5h,仍有50%以上的酶活力,具有较强的热稳定性。酯酶Tm1350对金属离子、抑制剂、变性剂和有机溶剂具有较强的抗性。      

门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina P10脂肪酶基因的克隆及其在酵母中的表达

采用同源克隆法获得了门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina P10脂肪酶基因的全长序列,DNA测序结果表明,该基因的DNA全长序列为801bp,编码267个氨基酸,推测蛋白相对分子量为29.95ku。将该脂肪酶基因连接到pPICZαA载体上得到重组表达质粒,转化Pichia pastoris X-33。脂肪酶基因在Pichia pastoris X-33中实现了分泌性表达,摇瓶发酵液上清酶活最大可达8U/mL。      

褐色喜热裂孢菌Thermobifida fusca产麦芽糖α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以T.fusca基因组DNA为模板,PCR分别扩增不包括和包括其基因前段信号肽的产麦芽糖淀粉酶的基因片段tfa和sptfa,并克隆至表达载体pSE380上,获得重组质粒pSE380-tfa和pSE380-sptfa,以大肠杆菌JM109为宿主细胞大量表达融合蛋白,利用金属镍亲和层析对菌株JM109/pSE380-tfa表达的α-淀粉酶进行纯化,SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为64ku,K m值为1.305mg/mL,最适反应温度为60℃,最适pH为7.0;检测到菌株JM109/pSE380-sptfa的培养基上清有相当一部分酶活。本研究麦芽糖α-淀粉酶与可溶性淀粉反应,经HPLC检测产物均为麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖的混合物。因此麦芽糖α-淀粉酶在生产高麦芽糖浆上起到了一定的作用。      

岷山红三叶草异黄酮合酶基因的克隆及序列分析

从岷山红三叶克隆异黄酮合酶基因,并对序列进行比对和进化分析。建立岷山红三叶愈伤组织培养体系,采用RT-PCR扩增从愈伤组织总RNA中分离了异黄酮合酶基因,并将其克隆到pGEM-T Easy载体,测序,得到全长1575bp的片段。序列分析表明,异黄酮合酶基因含1575个核苷酸,和大豆等其他植物中异黄酮合酶具有很高的同源性。      

微小毛霉凝乳酶基因的克隆与表达

微小毛霉(Mucor pusillus)凝乳酶是微生物凝乳酶的主要来源之一,但与传统的牛凝乳酶比较具有一定的缺陷。为将其采用基因工程的方法进行改造获得理想的凝乳酶,本研究克隆到微小毛霉凝乳酶基因,将其插入原核表达载体pTWlN1中,使之与几丁质结合域(CBD)一内含肽(intein)融合,获得原核表达质粒pTWIN1/M。转化大肠杆菌BL21(DE3),后经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析,获得了重组蛋白。