常压室温等离子体诱变与微生物微液滴培养选育谷胱甘肽高产菌株

为提升野生毕赤酵母菌株BY-1产谷胱甘肽的能力,通过常压室温等离子体（atmospheric and room temperatureplasma,ARTP）诱变技术得到诱变菌株BY-1-26。进一步在摇瓶培养过程中添加1,2,4-三氮唑,提高诱变菌株产量。最后将1,2,4-三氮唑作为筛选因子,利用微生物微液滴培养（microbial microdroplet culture system,MMC）仪对诱变菌株进行适应性进化,获得了1株高产谷胱甘肽的突变株BY-2-24,并对其遗传稳定性进行研究。结果表明：出发菌株BY-1经过ARTP诱变处理、抗性梯度平板初筛、MMC适应性进化、摇瓶复筛等,可以选育高产谷胱甘肽突变株。突变株BY-2-24摇瓶产量达（312.13±2.62）mg/L,较出发菌株提高134.26%,且经过7次传代培养,仍然具有较好的遗传稳定性。同时,生物量提高118.33%,表明诱变菌株的生长能力得到提高。研究表明,ARTP与MMC联合应用作为一种简便高效的微生物诱变方式,可用于定向诱变筛选高性能微生物菌株,为高通量选育目标菌株提供了参考。     

常压室温等离子体诱变与微生物液滴培养系统联用筛选L-组氨酸产生菌

利用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术,对野生型谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC 14067诱变处理。通过全自动高通量微生物液滴培养系统（MMC）和平板选育组氨酸结构类似物的抗性突变株。使用48孔板发酵初筛及摇瓶发酵复筛,最终从耐受3-氨基-1,2,4-三氮唑10 g/L和D-组氨酸8 g/L的抗性突变株中筛选得到菌株Cg-F4,其L-组氨酸产量为（0.561±0.016）g/L,并且经过7次连续传代实验验证了该菌株稳定性良好。     

产褐藻胶裂解酶菌株筛选与高产酶菌株的ARTP诱变选育

该研究采用平板酶解圈法从南海海域海藻、动物及沉积物样品中筛选产褐藻胶裂解酶细菌,对筛选菌株进行分子生物学鉴定,并利用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术选育高产褐藻胶裂解酶菌株。结果表明,共分离筛选得到酶活较高的细菌14株,16S rDNA比对分析结果表明,它们隶属于3个门、5个纲、7个目、8个科、9个属,其中有5株菌（占35.7%）可能代表着新的分类单元。以高产褐藻胶裂解酶海藻类芽孢杆菌（Paenibacillus algicola）HB172198T作为原始菌株,利用ARTP诱变技术选育获得2株褐藻胶裂解酶活力明显提高的突变株（编号分别为30-19、80-6）,其酶活力分别比原始菌株提高了32.6%和21.6%,且连续6次传代培养诱变菌株的产酶遗传性状稳定。     

常温常压等离子体诱变选育高产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌

以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）23798为原始菌株,对其进行常温常压等离子体（ARTP）诱变,以磺胺胍抗性和氨基酸与茚三酮特异显色为筛选标记,以期得到高产L-异亮氨酸的诱变谷氨酸棒杆菌,并对其遗传稳定性进行研究。结果表明,原始菌株23798经过ARTP诱变处理180 s后,经0.4 mg/mL磺胺胍抗性筛选、多孔板高通量筛选、发酵培养复筛,选育出一株高产L-异亮氨酸诱变谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）B1。该菌株在摇瓶中发酵培养48 h,L-异亮氨酸产量达18.5 g/L,比原始菌株提高62.03%,且遗传性状稳定。     

一株产几丁质脱乙酰酶诱变菌株的培养基配方及发酵条件优化

以一株海洋来源产几丁质脱乙酰酶（CDA）的丝状真菌（Penicilium janthinellum）1-5-2为出发菌株,经紫外线诱变后获得一高产CDA菌株UV-210S。通过单因素试验得出该诱变菌株的最佳培养基配方为麦芽糖1.3%,牛肉浸膏2.6%,NaH2PO4 0.3%,CaCl2 0.1%,胶体几丁质0.5%;最佳发酵工艺条件为NaCl 1.5%,初始pH值为9.0,发酵温度30 ℃,摇床转速180 r/min,CDA最佳收集时间为72 h。经培养基配方及发酵条件优化后该诱变菌株的最高CDA酶活为16.76 U/mL,相比优化前的酶活提高了52%。     

纳他霉素高产突变菌株高通量筛选方法的建立

为了提高纳他霉素（natamycin）高产菌株诱变后的筛选效率,建立一种24孔深孔板/酶标仪发酵初筛和摇瓶发酵复筛的高通量筛选检测方法,得到在24孔深孔板发酵结果与摇瓶发酵有很好的一致性,证实了酶标仪检测可以替代高效液相色谱法检测用于突变菌株的快速高通量筛选。以褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus TUST01）作为出发菌株,通过多轮的紫外诱变、常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma,ARTP）以及硫酸二乙酯复合诱变、孔板初筛与摇瓶复筛,从887株突变株中筛选出遗传性稳定的高产菌株S. gilvosporeus Y-4-75,其摇瓶纳他霉素产量（5.95 g/L）与生物量（29.19 g/L）较出发菌株分别提高了31.93%和15.19%。     

几丁质脱乙酰酶高产菌株的选育及其发酵特性研究

以一株海洋丝状真菌（Penicillium janthinellum）UV-0S为出发菌株,通过多级紫外线诱变育种后获得几丁质脱乙酰酶（CDA） 高产突变株UV-3S,并对该菌株产CDA的发酵特性及其细胞壁几丁质的脱乙酰度（DD）进行研究。 结果表明,突变株UV-3S的胞外 CDA酶活力为11.05 U/mL,是出发菌株UV-0S的2.1倍。 该菌株产胞外CDA的最适初始pH值为9.0,最适无机盐为NaH2PO（4 11 mmol/L）, 胶体几丁质最适添加量为0.5%。 在此最佳发酵条件下,突变株UV-3S的CDA酶活力最高,为11.83 U/mL,说明CDA是一种诱导酶。 细 胞壁几丁质的脱乙酰度随真菌生长而增加,且在发酵96 h后脱乙酰度达到最高（90.52%）。     

常压室温等离子诱变选育L-色氨酸高产菌株

为了提升发酵法产L-色氨酸的生产效率,使用常压室温等离子(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)诱变育种技术,并结合结构类似物抗性定向筛选的方法,选育高产色氨酸菌株。将出发菌Escherichia coli AC-1042经过ARTP诱变处理后,在抗性培养基平板上筛选具有5-甲基色氨酸、对氟苯丙氨酸抗性的突变菌株,选取产酸高、遗传稳定的菌株重复进行ARTP诱变处理和抗性筛选,不断提高菌株对结构类似物的抗性水平。经过多次ARTP诱变处理和抗性筛选,获得1株色氨酸高产菌株ACTRP104,经过30 L发酵罐培养44 h后L-色氨酸质量浓度可以达到61.65 g/L,葡萄糖转化率达到20.64%,比出发菌分别提高了20.69%和17.81%。结果表明,ARTP诱变和结构类似物抗性筛选相结合,可以有效地获得色氨酸高产突变菌株,大大提高色氨酸的发酵生产技术水平,获得的色氨酸高产菌株ACTRP104具有较好的工业化应用前景。     

递推式ARTP-UV复合诱变筛选高产β-葡萄糖苷酶菌株

为了提高产酶能力,采用常压室温等离子体(ARTP)与紫外(UV)复合诱变技术对酿酒酵母G13、G21菌株进行递推式复合诱变,经过一轮ARTP诱变两轮UV诱变,摇瓶培养筛选到两株高产β-葡萄糖苷酶的菌株Dea-G13D1Z2、Dma-G21D1Z2,经连续5代发酵生产试验,产酶水平可分别稳定在240.93和173.38 U/mL,是出发菌株G13、G21酶活的4.61倍和3.59倍。递推式ARTP-UV是一种有效的微生物突变育种的方法,可有效应用于微生物育种工作。     

UV-ARTP复合诱变选育高产纤维素酶菌株

该研究以拟康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）TP-89为出发菌株，利用紫外（UV）和常压室温等离子体（ARTP）复合诱变方法对其进行诱变，并对其遗传稳定进行测定，以期筛选高产纤维素酶且稳定遗传的突变菌株。结果表明，出发菌株TP-89通过UV诱变100 s,ARTP诱变120 s后，筛选出一株纤维素酶产量高且稳定遗传的正突变菌株UA-67，其在产酶培养基上培养4 d时，滤纸酶活为2.59 U/mL、内切酶活为4.26 U/mL、外切酶活为7.79 U/mL，较出发菌株TP-89分别提高85.0%、125.4%和70.1%。     

高产花生四烯酸高山被孢霉的诱变育种研究

通过菌种选育获得具有优良产脂性能的菌株是实现微生物油脂工业化生产的重要前提。利用实验室前期构建的产油丝状真菌快速筛选技术,以前期筛选获得的一株性状优良的高山被孢霉TSM-3为出发菌株,通过常压室温等离子体(ARTP)诱变方法得到能够稳定遗传的高产突变菌株TSM-3-1,其油脂产量和花生四烯酸(AA)产量分别达到5.07 g/L和1.55 g/L,与出发菌株相比分别提高了47.81%和84.52%。将产油丝状真菌快速筛选技术与诱变育种相结合,提高了目标菌株筛选效率并强化了野生型菌株油脂合成能力,为产油丝状真菌菌种选育提供了新颖的研究思路及方法。     

基于ARTP技术选育维生素K2优势菌株及发酵培养基优化

本研究目的在于获得维生素K₂优势突变株,并利用响应面设计优化发酵培养基进一步提高其产量。采取常压室温等离子体诱变技术结合结构类似物抗性初筛、24孔板发酵复筛,对纳豆芽孢杆菌进行诱变选育,并应用Box-Behnken设计对发酵培养基进行优化。通过ARTP诱变选育得到一株维生素K₂优势突变株,维生素K2产量较初始菌株提高了3.23倍。Box-Behnken实验优化后,最佳值为K₂HPO₄（0.69 g/L）,甘油（66.01 g/L）和酵母粉（25.12 g/L）,发酵后维生素K₂产量较优化前提高了56.7%。通过ARPT技术诱变选育出一株维生素K2优势突变株,采用响应面法优化发酵培养基。实验结果表明,突变株具有潜在的生产应用价值,建立的育种方法也可为其他工业微生物的选育提供有益的参考,对提高人们的健康水平具有十分重要的意义。     

桑叶中α-葡萄糖苷酶抑制剂产生菌的分离鉴定及诱变选育

从桑叶中筛选出一株糖尿病潜在治疗药物(α-葡萄糖苷酶抑制剂)产生菌,为进一步提高抑制剂量,采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)技术进行了诱变育种,并初步研究其理化性质及稳定性。在分离得到的188株桑叶内生菌中,以4-硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(4-nitrophenyl-α-Dglucopyranoside,PNPG)法筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂,筛选到一株细菌Xu W-LB-188,其发酵上清液对α-葡萄糖苷酶抑制率达52.67%。根据菌株形态特性及16S rDNA序列,初步鉴定为萎缩芽孢杆菌。对此菌株进行ARTP诱变,高通量筛选880株突变株,其中突变株T-690抑制活性较出发菌株提高了40.61%,抑制率高达73.25%。实验结果表明,该α-葡萄糖苷酶抑制剂主要存在于发酵液中,是一种极性较大的水溶性胞外产物,且具有良好的热稳定性。     

常压室温等离子体诱变技术选育高产Monacolin K紫色红曲霉突变株

采用常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma,ARTP）射流诱变技术处理紫色红曲霉菌株M-1,选育高产Monacolin K突变株,为Monacolin K的发酵生产提供优良菌株。确定等离子体处理条件,采用稀释平板培养法挑选突变株,高效液相色谱法分析突变株发酵液的Monacolin K产量,借助扫描电子显微镜观察诱变处理前后菌体微结构特征。结果表明：ARTP对紫色红曲霉菌株具有较强的致死和致突变效应,ARTP处理30 s紫色红曲霉菌株诱变致死率达到84%,处理90 s时其致死率约为92.6%,可获得较高的正突变率（23.8%）;筛选得到突变株23的Monacolin K产量达到428.14 mg/L,较初始菌株M-1提高了111%。ARTP作用于紫色红曲霉,可引起菌株形态学特征发生改变,突变株的菌落色泽、菌丝体和孢子形态等特征均有一定变化;ARTP产生的活性粒子可透过细胞膜作用于DNA物质,引起DNA发生多样性损伤、不完全修复突变,形成遗传稳定的突变株。