表面活性剂稳定性碱性蛋白酶纯化及性质研究

从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XG12发酵液中分离纯化表面活性剂稳定性碱性蛋白酶,并对酶学性质进行研究。利用硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析等方法,分离纯化到了均一的酶蛋白,酶纯度提高了42.6倍,回收率为25.3%。SDS-PAGE及Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析显示酶蛋白为单亚基蛋白,分子质量约为29.5kD。在pH7.0～11.0范围内酶活性及稳定性较高,最适作用pH值为10.0,最适作用温度40℃。Mg2+、Ca2+及Mn2+对酶有明显激活作用。丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂强烈抑制酶活性,表明所纯化到的蛋白酶为丝氨酸蛋白酶。酶分别对终质量浓度为0.1g/100mL的阴离子表面活性剂SDS、阳离子表面活性剂CTAB和体积分数为1%的非离子型表面活性剂Tween-80、Tween-20、Triton X-100以及氧化剂均具有很强的稳定性。     

青藏高原土壤低温产蛋白酶菌株的筛选及酶学性质研究

从青藏高原土壤样品分离保藏的菌种中筛选到低温条件下产蛋白酶菌株LS20-2,对其进行生理生化试验以及分子生物学鉴定,并对其发酵液进行酶学性质初步研究。结果表明,该菌被鉴定为皮氏类芽孢杆菌（Paenibacillus peoriae）,产蛋白酶的最适反应pH值为7.0,最适温度为40 ℃。在pH5.0～7.0之间、温度0～40 ℃时酶活稳定,金属离子Fe2+、Zn2+及Triten X-100能抑制蛋白酶活性,金属离子Mn2+及表面活性剂Tween-20、Tween-80能提高蛋白酶活性。     

枯草芽孢杆菌B.SUBT12酶学性质研究

考察分离得到的一株产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌B.SUBT12最适作用温度、pH值以及温度、pH值、金属离子和表面活性剂对酶稳定性的影响。试验研究表明:该酶最适作用温度为55℃,最适作用pH为7.5,酶在55℃反应45min仍有50%的酶活力,热稳定性较好。金属Ca2+和表面活性剂Tween-80对酶有一定的激活作用,但激活作用不显著。     

产低温弹性蛋白酶菌株的筛选及酶学特性分析

筛选获得一株产生低温型弹性蛋白酶菌株并研究酶学性质,为该酶在肉类嫩化中应用奠定理论基础。在不溶性的弹性蛋白琼脂平板上,以弹性蛋白作为惟一氮源,根据水解圈直径和菌落直径的比值筛选到一株分泌低温型弹性蛋白酶的菌株,命名为XZE116,通过形态学、生理生化试验以及16s rDNA序列分析,该菌株鉴定为短芽孢杆菌(Bacillus brevis)。菌株所产弹性蛋白酶最适作用pH值8.0,在较广的pH值范围(7.0～12.0)内酶稳定性较好。酶最适作用温度25℃,在40℃以下保温2 h,酶稳定性好。浓度为5 mmol/L的Mg2+离子对酶有激活作用,但Hg2+、Pb2+强烈抑制酶活性。丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)强烈抑制酶活性,但E-64对酶活性没有影响,表明菌株XZE116弹性蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。0.1%的阴离子表面活性剂SDS、阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)以及非离子型表面活性剂Triton X-100对酶活性有轻微的抑制作用。这些酶的优良生化特性赋予了该酶在肉品工业中具有潜在的应用价值。     

海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchra HH407低温碱性蛋白酶的发酵条件和酶学性质研究

对一株分离自连云港海域的海洋细菌(Pseudoalteromonas flavipulchra HH407)菌株产蛋白酶的条件及酶学性质进行研究。结果表明,在发酵温度为20℃、培养基pH 值为8.0、NaCl 质量浓度为20g/L、接种量2.5% 和装液量20% 时产酶较高。甘露醇、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、鱼粉和酵母粉有利于蛋白酶的产生。该酶的最适作用温度为35℃,0℃时相对酶活力达21.7%。45℃条件下保温60min 后酶活力仍能保持80% 以上。酶的最适作用pH 值为10.0,pH 值为7.0～11.0 范围为时,酶活力相对比较高。酶在pH8.0～11.0 范围内稳定,最稳定的pH 值为10.0,属于低温碱性蛋白酶,Mn2+、Cu2+、Ca2+ 对其具有较强的激活作用,Hg2+ 较强地抑制其酶活力。苯甲基磺酰氟(PMSF)能完全抑制该蛋白酶,EDTA 无影响表明该酶属于丝氨酸蛋白酶。     

天祝传统藏曲中蛋白酶产生菌的筛选与酶学特性研究

采用酪蛋白平板对藏香型白酒大曲中高产蛋白酶菌株进行分离筛选,然后通过硫酸铵沉淀、透析和DEAESepharose FF阴离子交换层析对其产生的蛋白酶进行纯化,并研究其酶学性质。结果表明：菌株ZP-8产酶活力最高,为197.6 U/mL,经鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。纯化后测得酶的分子量约为45.43 kDa,最适pH值为8.0,在pH 7.0～11.0的范围内稳定性好,属于碱性蛋白酶。该酶最适反应温度为50℃,在30～50℃范围内稳定性较好;Mg2+、Na+、Ca2+和Fe2+对蛋白酶相对酶活力无显著影响（P>0.05）,Cu2+和Mn2+具有显著的激活作用（P<0.05）。本研究对酒曲中产蛋白酶微生物的开发利用具有重要的参考价值。     

雅致放射毛霉3.2778羧肽酶性质及其活性中心结构的研究

固态发酵雅致放射毛霉菌株(Actinomucor elegans)3.2778得到羧肽酶粗酶液,以N-苄氧羰酰基-L-苯丙胺酰-L-亮氨酸(N-CBZ-Phe-Leu)为底物,采用镉-茚三酮法测定羧肽酶水解产物。结果表明:雅致放射毛霉3.2778羧肽酶最适作用pH值范围为6.5～7.2,最适作用温度范围在40℃～45℃,最适作用温度为40℃,在30℃～40℃具有良好的温度稳定性。0.99mmol/L金属离子中,Mg2+对羧肽酶活力表现出显著的促进作用,酶活提高37%;而Cu2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+可以抑制绝大部分酶活,残留的相对酶活力约10%。9.1mmol/L金属蛋白酶抑制剂1,10-邻菲啰啉(OP)和丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)和二异丙基磷酰氟(DFP)均可以完全抑制该酶活性,同时,对巯基有修饰作用的蛋白酶抑制剂PCMB、DTT、碘乙酸和β-巯基乙醇对羧肽酶有强烈的抑制作用。因此,推断该酶可能是一种丝氨酸羧肽酶,其活性中心有丝氨酸残基和二硫键结构,酶活受Mg2+激活。     

中性蛋白酶芽孢杆菌BX-4产酶条件及部分酶学性质

采用稀释平板分离法从土壤中分离到一株产中性蛋白酶芽孢杆菌BX-4．通过单因素碳、氮源以及正交试验确定了最佳产酶培养基配方，同时还研究了起始pH值、金属离子、接种量对产酶的影响以及温度、pH值、金属离子以及表面活性剂对酶稳定性的影响；以最佳培养基为发酵培养基，于37℃、160r／min振荡培养48h，酶活达2519．35U／mL；该酶最适作用温度为55℃，最适作用PH值为7．5，在pH7．5缓冲体系中，55℃反应60min后仍有50％的酶活力，Ca^2＋和表面活性剂对酶有一定的激活作用，但激活作用不明显。     

单环刺螠内脏粗蛋白酶的提取工艺及酶学性质

以酶比活和酶活为指标,主要研究影响单环刺螠内脏粗蛋白酶提取的固液比、浸提时间、浸提温度和pH值4个因素。响应面分析结果表明,单环刺螠内脏粗蛋白酶提取的最优工艺:固液比1∶220、浸提时间30 min、温度12℃、pH 8.0。在此工艺条件下,单环刺螠粗蛋白酶酶比活为339 U/mg蛋白。该粗蛋白酶的最适作用温度70℃和最适作用pH值8.0。金属离子Na+,Fe2+,Fe3+对该酶有激活作用,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Cu2+,Ba2+,Mn2+,K+对该酶具有抑制作用。酶动力学方程表明,该酶的最大反应速率17.86 U/mL,米氏常数1.225 mg/mL。     

枯草芽孢杆菌HS18碱性蛋白酶分离纯化及其性质研究

从合浦珠母贝肠道中分离鉴定到酶菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS18,将枯草芽孢杆菌HS18的发酵液,经过硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex A-50柱层析、Sephadex G-100柱层析3步纯化后得到了单一的酶蛋白,回收率为11.4%;经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得酶蛋白分子量约为31ku;该蛋白酶最适反应温度为50℃,最适pH10.0;K＋及Na＋对酶有明显激活作用;丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂（PMSF）能强烈抑制酶活性。表明所纯化到的蛋白酶为丝氨酸碱性蛋白酶。     

高产蛋白酶菌株的分离、鉴定及酶学性质研究

该研究旨在从非传统环境（磷矿）中分离、筛选高产胞外蛋白酶菌株，对菌株进行形态学观察、生理生化和分子生物学鉴定，并研究其蛋白酶的酶学性质。结果表明，分离筛选到一株蛋白酶高产菌株，编号为PB5，该菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），该菌株产胞外蛋白酶活力为562.3 U/mL，胞外蛋白酶的最适pH值为10，在pH 7～10有较好的pH稳定性；最适温度为60 ℃，20～50 ℃时有较好的稳定性；Na+、Mg2+、Mn2+、K+对蛋白酶活力有明显的促进作用；Fe2+、Ag+、乙二胺四乙酸（EDTA）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、十二烷基硫酸钠（SDS）对蛋白酶活力有明显抑制效果。     

LiCl-ARTP复合诱变选育高产碱性蛋白酶菌株及其发酵条件优化

以地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）E-417为出发菌株,采用氯化锂（LiCl）-常压室温等离子体（ARTP）复合诱变法对其进行诱变,通过酪蛋白平板初筛、摇瓶复筛、遗传稳定性验证筛选高产碱性蛋白酶的优良菌株,并通过单因素及响应面试验对其发酵产酶条件进行优化。结果表明,在氯化锂添加量为1.5%、ARTP照射时间为45 s的最适复合诱变条件下筛选得到1株高产碱性蛋白酶的优良菌株F-3,酶活达到12 147 U/mL,且该菌株传代8次后仍具有良好的遗传稳定性,其最适发酵培养基成分为玉米粉41 g/L、豆饼粉40 g/L、碳酸钠2.1 g/L、磷酸氢二钠2.0 g/L;最适发酵条件为发酵温度37 ℃、初始pH值7.0、接种量8%。在此优化条件下,碱性蛋白酶酶活达到16 156 U/mL,较原始菌株提高75%。     

中国对虾蛋白酶性质的研究

采用酶学分析方法研究了中国对虾蛋白酶的性质。结果表明,该酶最适温度为60℃,最适pH为9.0,是一种碱性蛋白酶。此酶在50℃以下及pH 7.0~10.0稳定性较好。以酪蛋白为底物,蛋白酶的最适底物浓度为2%。60℃时,该酶的半衰期为22 min,70℃时则为7 min。低浓度的EDTA对酶活有抑制作用,Mn2+、Ca2+、Mg2+对蛋白酶有一定的激活作用,而Cu2+、Zn2+、Fe2+、Pb2+对酶活有不同程度的抑制作用,可推断该酶是一种金属蛋白酶。     

浮游球衣菌S9产铁氧化酶发酵条件优化及酶学特性研究

通过单因素及正交设计试验,研究了浮游球衣菌S9产铁氧化酶的发酵条件,并探讨了铁氧化酶的酶学性质。结果表明,菌株S9的最适产酶发酵培养基配方为柠檬酸铁铵1.0%,NH4Cl 0.1%,K2HPO4 0.05%,MgSO4·7H2O 0.05%,CaCl2·6H2O 0.01%;最佳发酵条件为：培养初始pH7.0,培养温度30 ℃,装液量50 mL/250 mL,转速150 r/min,培养时间84 h。在此优化发酵条件下,菌株S9的铁氧化率可达75.25%,与未优化前相比,提高了42.28%。所产铁氧化酶的最适温度为30 ℃,最适pH为7.5,Mg2+、K+、Na+对酶的活性具有增强作用,Pb2+、Ag+会抑制酶的部分活性,且Mn2+、Zn2+对酶具有很强的抑制作用。对该菌最适培养基和产酶条件及酶学性质,对铁氧化酶在给排水工程及其分离纯化和活性保护具有一定的参考价值和指导意义。     

紫色红曲霉FBKL3.0018产酯化酶的酶学性质研究

以从紫色红曲霉FBKL3.0018中固态发酵得到的粗酶制剂为研究对象,对该菌株的酯化酶酶学性质进行了较系统的研究。通过单因素实验确定该酶最适温度为40 ℃,在30 ℃条件下稳定性较好,最适pH值为6.5,在pH5.5～7.5条件下稳定性好。Fe2+、Na+、Mn2+、Mg2+、Li+、Zn2+对酯化酶酶活力有抑制作用,Ca2+在低浓度时有促进作用,高浓度时有抑制作用。K+对酯化酶酶活力有促进作用,并且随着K+浓度的升高,促进作用逐渐增强。吐温-80、十二烷基硫酸钠（SDS）、聚乙二醇6000、阿拉伯胶4种表面活性剂对酯化酶酶活力都有抑制作用。另外,甲醇和乙醇对该酯化酶酶活力有抑制作用,甲酸、乙酸、乳酸对酯化酶酶活力有促进作用。乙酸乙酯在低浓度时对酯化酶酶活力有抑制作用,含量为30%时反而有促进酶活力的作用。酯化酶最大反应速度Vmax为0.016 mol/（L·min）,米氏常数Km为0.015 4 mol/L。     

漆酶对普拉红B的脱色性能研究

从温度、pH值、酶质量浓度、盐、金属离子等因素探讨了漆酶对普拉红B的脱色条件,分析了漆酶的脱色动力学性能。结果表明:在温度60℃,pH值5.5及酶质量浓度0.2 g/L的条件下,漆酶对普拉红B的脱色率达95.5%以上。元明粉对漆酶脱色的影响不大;随醋酸钠和氯化钠浓度的增加,脱色效果下降;PO34-、CO23-、Fe2+、Fe3+对漆酶脱色有一定的抑制作用,漆酶催化染料脱色反应的米氏常数Km值为846.82 mg/L。     

乙酸异戊酯高产菌脂肪酶的特性研究

以乙酸异戊酯高产菌株Loq-c为试验材料,从菌体中提取制备脂肪酶,研究其酶学特性,结果表明：该酶催化反应的最适温度在30 ℃左右,在40 ℃以下具有良好的热稳定性;催化体系的pH在6.0～7.0时,酶的相对活力和稳定性较高,而当pH≤4.0时酶表现得不稳定,酶活力低。金属离子Mg2+和Ca2+能明显促进酶的催化能力,Cu2+和Ag+能明显抑制酶的催化能力,Na+、K+和Zn2+对酶催化的影响不显著。正交试验结果表明,菌株Loq-c脂肪酶最佳酶活条件为：温度在30 ℃,pH值为7.0,Mg2+浓度为5.0 mmol/L。在此最佳条件下,酶活力高达535.8 U/mL。     

耐有机溶剂蛋白酶产生菌MSP05的筛选、鉴定及酶学性质研究

目的:从燕尾港受污染海域筛选耐有机溶剂蛋白酶产生菌,确定该菌的分类地位,并对其所产溶剂稳定性蛋白酶的酶学性质进行研究。方法:通过在培养基中添加20%(V/V)甲苯作为筛选压力,筛选耐有机溶剂极端微生物,通过产蛋白酶筛选培养基筛选产蛋白酶的菌株,并利用摇瓶发酵进行复筛,最后对产酶菌株进行鉴定并对粗酶的性质进行测定。结果:筛选获得耐有机溶剂蛋白酶产生菌MSP05,结合16S rDNA序列分析、形态学观察和生理生化性质将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。该酶的最适反应温度和pH分别为50℃和10.0,Cu2+、Mn2+对酶有激活作用,Mg2+、Fe3+和Ba2+对酶具有抑制作用。在50%乙醇中,25℃、140 r/min振荡72 h后仍能保持50%以上酶活力。结论:分离获得耐有机溶剂蛋白酶产生菌解淀粉芽孢杆菌菌株MSP05,对有机溶剂具有较好的耐受性,具有潜在的工业应用价值。