Microbulbifer salipaludis褐藻胶裂解酶的酶学性质研究

为获得可高效生产褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶,该文筛选出一种来源于Microbulbifer salipaludis的褐藻胶裂解酶（Microbulbifer salipaludis alginate lyase,Misa-aly）,并在大肠杆菌 Escherichia coli BL21（DE3）异源表达,分离纯化后进行酶学性质鉴定。结果表明,该酶最适pH值为8.5（Tris-HCl缓冲液）,最适温度为45℃,偏好底物为聚甘露糖醛酸,40℃下保温1 h酶活下降约50%。Misa-aly对Na+依赖性较低,以海藻酸钠为底物通过3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid,DNS）法测定酶活为（53.0±1.2）U/mg,反应产物是聚合度为2～4的寡糖,24 h后酶解转化率达到94.7%,底物海藻酸钠几乎全部酶解。     

褐藻胶裂解酶及其裂解产物的研究进展

从海洋生物中筛选提取有应用价值的酶类，已成为海洋生物资源开发的一个重要方面。近年来，对褐藻胶裂解酶及其降解产物——褐藻寡糖的研究受到人们的普遍关注。就这两方面作一较为详细的总结与阐述。     

褐藻胶裂解酶的研究进展

褐藻胶是一种由L-古罗糖醛酸和其C5差向异构体D-甘露糖醛酸结合而成的线性高分子多糖。褐藻胶裂解酶能够通过β消去机制催化褐藻胶降解产生具有多种生物活性的褐藻胶寡糖。对于酶的鉴定分析将会拓展酶和寡糖在食品、农业等领域的应用范围。因此本文简要阐述了酶的分类、测定方法、构效关系以及生物学功能,并就其应用的最新进展进行了展望。     

褐藻胶裂解酶的研究进展

褐藻胶是一种由L-古罗糖醛酸和其C5差向异构体D-甘露糖醛酸结合而成的线性高分子多糖。褐藻胶裂解酶能够通过β消去机制催化褐藻胶降解产生具有多种生物活性的褐藻胶寡糖。对于酶的鉴定分析将会拓展酶和寡糖在食品、农业等领域的应用范围。因此本文简要阐述了酶的分类、测定方法、构效关系以及生物学功能,并就其应用的最新进展进行了展望。      

鲍鱼褐藻胶裂解酶基因的原核表达及酶学性质

褐藻胶寡糖因其内在的生物功能具有良好的应用前景,褐藻胶裂解酶可将褐藻胶降解为褐藻胶寡糖,基因工程技术为高效生产褐藻胶裂解酶提供了技术方法。从鲍鱼肝胰腺中提取RNA,通过RT-PCR得到cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增得到褐藻胶裂解酶基因algl,将其与pET-28a(+)载体连接,并在大肠杆菌BL21菌株中进行高效诱导表达。将工程菌体超声波破碎后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,利用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化重组蛋白Algl,继而对其进行酶学特性研究。细胞破碎物酶活检测及SDS-PAGE分析表明,重组蛋白为包涵体,相对分子量约为32 000。包涵体纯化、复性后的酶活为15.6 U/mL,比酶活为644.6 U/mg。纯化后的工程酶酶学性质研究表明:该酶最适温度35℃;最适pH值为8.0;只能降解多聚甘露糖醛酸(polyM)而不能降解多聚古洛糖醛酸(polyG);催化褐藻胶的K_m值为1.71 mg/mL,V_(max)为19.08 U/mL。重组酶Algl对多聚甘露糖醛酸的底物特异性和适冷性具有潜在的生物技术和工业应用。     

酶解制备褐藻寡糖工艺优化及活性研究

为了优化褐藻胶裂解酶酶解褐藻酸钠制备褐藻寡糖的工艺条件,在单因素试验的基础上,运用软件DesignExpert 8.0.6设计中心组合试验,以反应体系中还原糖生成量为评价指标,采用响应面分析法确定褐藻胶裂解酶酶解的最优工艺,通过测定2,2'-联氮双-(3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸)二铵盐[2,2'-azinobis(3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid)ammonium salt,ABTS]自由基的清除能力、抑菌指数和对对虾多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性的影响,检测酶解制备的褐藻寡糖的抗氧化活性和抑菌活性。结果显示最佳工艺条件:酶解时间16 h、体系pH值8.4、酶解温度30℃、底物质量浓度8 g/L。此条件下,还原糖质量浓度达到1 660 mg/L。结果显示制备的褐藻寡糖具有较强的清除ABTS~+自由基的能力和抑菌能力,并能有效的抑制对虾多酚氧化酶的活性。     

响应面法优化海洋弧菌产褐藻胶裂解酶发酵培养基

采用响应面法优化海洋弧菌X511的产酶发酵培养基,提高其胞内褐藻胶裂解酶产量。通过单因素试验研究了不同碳源、不同氮源、海藻酸钠、氯化钠、蛋白胨、硫酸亚铁、硫酸镁和磷酸氢二钾对菌株产胞内酶活力的影响,在此基础上,利用Plackett-burman试验确定海藻酸钠、氯化钠、蛋白胨和硫酸镁对胞内酶产量的影响。通过响应面试验构建回归方程,结果表明,最佳发酵培养基成分为海藻酸钠9.0 g/L,NaCl 31.6 g/L,蛋白胨15.0 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L。在此条件下,该菌株的胞内褐藻胶裂解酶的活力为（20.65±0.14） U/mL,较优化前的酶活提高了64.4%。     

丁香假单孢菌重组褐藻胶裂解酶的酶学性质及酶解产物的抗氧化活性

目的：将丁香假单孢菌的褐藻胶裂解酶进行克隆表达和纯化,研究重组酶的酶学性质及酶解产物的抗氧化活性,为进一步研究该酶的结构与功能奠定良好的基础。方法：利用PCR扩增褐藻胶裂解酶基因,将它克隆至表达载体pET-28a;表达产物用亲和层析纯化,研究重组酶的酶学性质;通过测定酶解产物的还原能力和清除ABTS·+和·OH自由基的能力,分析酶解产物的抗氧化活性。结果：来自丁香假单孢菌的重组褐藻胶裂解酶的分子质量为40.8 ku。该重组酶专一性降解聚甘露糖醛酸,酶的最适反应温度和pH分别为30 ℃和7.5,温度低于50 ℃时稳定。除了SDS和DTT,重组酶对其它抑制剂和去垢剂具有较好的抗性。酶解产物对ABTS·+和·OH自由基的半数抑制剂量IC50分别为1.56 mg/mL和0.56 mg/mL,还原能力较强。结论：该重组褐藻胶裂解酶的酶解产物有一定的抗氧化活性,具有应用潜力。     

响应面优化微泡菌ALW1产褐藻胶裂解酶的发酵条件

采用单因素和响应面法对产褐藻胶裂解酶菌种Microbulbifer sp.ALW1发酵产酶的培养条件进行优化.通过单因素实验,得到发酵条件如下:培养基初始pH 7.5,接种量5％,装液量50 mL,温度25℃,最大酶活力达到117.1 U/mL.在单因素实验的基础上,通过Box-Behnken设计和响应面分析,得到最佳的发酵培养条件:培养基初始pH 8.0,接种量6.5％,装液量50mL,温度23℃,褐藻胶裂解酶活力达到130 U/mL,比基础培养条件下提高16.5％.     

产褐藻胶裂解酶菌株筛选、鉴定与酶学性质研究

目的：筛选能够降解褐藻胶的新菌株,对发掘具有潜在产业化价值的褐藻胶裂解酶具有重要意义。方法：以褐藻胶为唯一碳源,从辽宁省大连市渤海湾沉积物中分离出高产褐藻胶裂解酶菌株。通过形态学、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析,确定了它们的分类地位,并对其酶学性质进行了研究。结果：通过筛选,得到一株高产褐藻胶裂解酶的菌株并命名为LG-3。结合其形态学特征、生理生化指标检测以及16S rDNA系统发育树分析,初步确定该菌株属于坚强芽孢杆菌(Bacillus sp. LG-3)。LG-3菌株摇瓶发酵24 h后产褐藻胶裂解酶的酶活力为32.11 U/mL。最适的反应温度为30℃,最适p H值为8.0。金属离子Mn²⁺、Na⁺、Fe³⁺促进酶活性,Zn²⁺、Ag⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺对酶活有较强的抑制作用。化学试剂β-Mercaptoethanol、urea、EDTA、Triton-100、Tween-80、2,3...     

响应面法优化组成型壳聚糖酶酶解条件

以壳聚糖为原料,通过蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）发酵所得壳聚糖酶水解壳聚糖产生壳寡糖,对酶解pH、温度、底物浓度和时间分别进行单因素试验,并在此基础上,通过响应面法研究这4种因素对壳寡糖产量的影响,优化酶解条件。结果表明,壳聚糖酶酶解的最佳条件为pH值5.6,酶解温度53 ℃,壳聚糖质量分数2.09%,酶解时间157 min。在该优化条件下,壳寡糖的浓度为35.73 μmol/mL,与模型预测值35.476 μmol/mL接近,则该模型可用于优化壳聚糖酶酶解条件。     

响应面设计法优化花生分离蛋白酶解条件的研究

以花生粕为原料,利用响应面设计对其花生分离蛋白的酶解条件进行了优化。通过对花生分离蛋白水解的最佳用酶进行了筛选,确定以碱性蛋白酶Alcalase水解效果最好。在单因素实验基础上,以水解度为指标,设计了响应面分析方案,通过数学推导及实验分析,得出Alcalase可控酶解花生分离蛋白的动力学模型及相关参数:Alcalase水解花生分离蛋白的最优工艺参数为反应温度53.11℃、酶浓度为135.94μL/g、pH为8.05、预测蛋白水解度为24.15%,实际结果与拟合方程预测结果(24.57%)基本吻合。      

响应面法优化超高压-酶解制备玛咖酒工艺

该研究选用甘肃玛咖为原料,采用超高压-酶解技术制备玛咖酒。以总生物碱提取率和感官评分为评价指标,利用单因素试验和响应面法优化玛咖酒制备工艺条件。结果表明,玛咖酒制备最佳工艺条件为：酶解压力110 MPa,酶解温度60 ℃,乙醇体积分数60%。在此优化制备工艺条件下,总生物碱提取率为67.28%,感官评分为96.06分。玛咖酒呈金黄色,酒质澄清,无杂质,具有玛咖的天然野草根气味及特殊辛辣味。     

响应面法优化猕猴桃皮渣酶解取汁工艺

以猕猴桃皮渣为原料,研究了果胶酶对皮渣出汁提高率的影响。在单因素分析的基础上,采用Box-Behnken中心组合实验,建立二次回归方程模型,模型相关系数R2=0.9636,对模型进行方差分析,确定了猕猴桃皮渣的最佳酶解工艺参数:酶解温度48.98℃、p H3.42、酶解时间3.32h、果胶酶用量0.26mg/g,在此条件下,皮渣的实际出汁提高率为（44.21±1.22）%,与理论值45.73%的相对误差为2.46%。      

响应面法优化酶法制备低盐虾酱的工艺

以市售新鲜小海虾为原料,经中性蛋白酶酶解制备低盐虾酱.在单因素试验的基础上,利用响应面分析法,以游离氨基态氮(FAN)值为考察指标,对酶法加工低盐虾酱的酶解条件即中性蛋白酶添加量、酶解温度、酶解时间和食盐添加量进行优化,建立相应的回归模型为:Y=-1.92416+1.09113X1+0.10297X2+0.36844X3-0.08440X4-0.05065X1X2+0.14153X1X4-0.00091X22-0.07095X32.以上4个因素影响游离氨基态氮(FAN)值的优先次序为食盐添加量＞酶添加量＞酶解时间＞酶解温度;确定酶法制备低盐虾酱的最佳工艺参数为中性蛋白酶添加量0.33％、食盐添加量为15.12％、酶解温度为50.18℃、酶解时间为2.05h,在此条件下,低盐虾酱的游离氨基态氮(FAN)值为0.587g/100g.本产品为紫红色,有光泽,香气浓郁,具有虾酱特有的风味、咸味适宜,口感细腻,质地均匀,无异味.且工艺流程简单、可行.     

基于响应曲面法的中老年营养米粉酶解工艺优化研究

以优质碎米为原料,利用单因素实验、Box-Behnken实验设计和响应面分析研究浆料浓度、酶解时间、酶解温度、酶添加量对水解程度（DE值）的影响,优化酶解工艺参数,结合喷雾干燥技术,制得中老年营养米粉基料。优化结果表明,在浆料浓度13%、酶解时间42 min、酶解温度69℃、酶添加量0.34%条件下生产的米粉基料水解程度可达33.02%,米粉中无残存酶活力,淀粉消化指数比非酶解工艺提高21.71%,达到50.62%。      

响应曲面法优化番茄汁加工工艺

为优化番茄汁加工工艺,以出汁率为指标,在单因素实验基础上,进行响应面实验分析得到最佳工艺参数为:纤维素酶添加量0.08%,酶解时间79min,酶解pH4.0,酶解温度54℃,此时番茄出汁率为90.08%。同时建立了番茄出汁率的二次数学模型,对出汁率具有很好的预测作用。      

基于响应面法的蚕蛹蛋白降血脂肽的酶解条件优化

基于响应面法对中性蛋白酶降解蚕蛹蛋白制备降血脂肽的酶解条件进行了优化。得到制备蚕蛹蛋白降血脂肽的最佳酶解条件为:酶量5.1%（w/w）,酶解时间5h,酶解温度52℃,酶解pH=7.0,底/水比（w/v）=3.9%。在此条件下,蚕蛹蛋白降血脂肽对3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）的抑制率为45.24%。建立了基于蚕蛹蛋白降血脂肽酶解条件的优化模型。验证实验结果表明该模型的预测准确率达97.31%。      

响应面法优化齐口裂腹鱼肉蛋白酶解工艺的研究

以齐口裂腹鱼肉为原料,采用不同蛋白酶水解鱼肉蛋白,筛选出最佳水解用酶为动物蛋白水解酶。在单因素实验基础上,根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理,选择对实验结果影响较大的四个因素（水解时间、水解温度、加酶量、料液比）做响应面优化实验,以齐口裂腹鱼肉的水解度为响应值建立数学模型,依据回归分析各因素的影响和交互作用,得出齐口裂腹鱼肉水解最佳工艺条件为:水解时间为4.5h,水解温度为54℃,加酶量为5080U/g,料液比为1∶3.2（g/mL）,pH为8.0,在此条件下做验证实验,得到水解度为13.67%,与理论预测值13.33%相比,其相对误差约为2.55%。响应面法优化齐口裂腹鱼肉水解工艺能为实践提供一定的指导意义。