人纤溶酶原/纤溶酶的研究进展

人纤溶酶(plasmin,Plm)是人纤溶酶原(plasminogen,Plg)的活化形式,其为纤溶系统的重要组成部分。Plg/Plm的生理功能使其在临床中具有很好的应用前景,目前已有Plg/Plm产品进入临床试验阶段。本文就Plg/Plm转化机制、相关疾病及功能、临床(前)研究以及生产工艺作一综述。     

大鼠血纤溶酶原的纯化和鉴定

以大鼠血清为原料,采用硫酸按盐析法,Lysine－Sepharose4B、Red－SepharoseCL6B和SephadexG150层析法,分离提纯了大鼠血纤溶酶原（Plasminogen,PGn）。利用尿激酶依赖的酶谱分析法鉴定其酶原的生物活性,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）对其纯度和分子量分析。结果表明纯化得到的为90kDa的单一组分的纤维蛋白溶酶原。这种纯化方法的建立为进一步大量制备PGn奠定了基础。     

人纤溶酶原饼环区5蛋白的原核表达体系的建立

目的　构建人纤溶酶原饼环区 5 (hPK 5 )蛋白原核表达载体 ,并进行表达和鉴定 ,为获取大量高纯度、具有生物活性的hPK 5蛋白奠定基础。方法　以纤溶酶原cDNA为模板 ,PCR扩增hPK 5基因 ,经酶切后构建表达载体pBV2 2 0 /hPK 5 ,转入大肠杆菌JM10 9进行温控诱导表达 ,表达产物经纯化、复性后 ,检测其抑制鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)血管新生的生物学活性。结果　带有pBV2 2 0 /hPK 5的大肠杆菌表达的目的蛋白占菌体总蛋白的34 8% ,其表达蛋白具有His tag抗原活性和野生活性。结论　已成功构建了pBV2 2 0 /hPK 5重组质粒 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。     

纤溶酶原激活物抑制剂-1的研究进展

纤溶酶原激活物抑制剂-1是纤维蛋白溶解系统成员纤溶酶原激活剂,体内纤溶酶原激活物抑制剂-1水平和活性的变化在血栓性疾病以及肿瘤的发生、发展过程中发挥着极其重要的作用,但目前研究报道的纤溶酶原激活物抑制剂-1小分子抑制剂还处于前期开发阶段,未见有相关药物上市。文章综述了近年来纤溶酶原激活物抑制剂-1的研究进展。     

人纤溶酶原K5基因在毕赤酵母中的表达及其抗肿瘤活性

目的在毕赤酵母中表达人纤溶酶原K5基因,并检测hK5蛋白的抗肿瘤活性。方法根据酵母遗传密码的偏爱性优化设计hK5基因,构建重组表达质粒p819-8α-hK5,经G418加压筛选和甲醇诱导表达,并对摇瓶发酵条件进行优化。表达的hK5蛋白经纯化后,通过荷H22肿瘤昆明小鼠模型检测其抗肿瘤活性。结果筛选到2株高表达hK5蛋白的转化子,摇瓶表达量超过150mg/L,纯化后的蛋白纯度大于95.0%,并能够显著抑制昆明小鼠H22肿瘤的生长。结论hK5基因能够在毕赤酵母中高效分泌表达,且表达的hK5蛋白具有良好的抗肿瘤活性。     

纤溶酶原饼环区5蛋白重组大肠杆菌高效表达体系的建立

目的　建立纤溶酶原饼环区 5 (Humanplasminogenkringle 5 ,hPK 5 )蛋白重组大肠杆菌高效表达体系 ,为高密度发酵创造条件。方法　观察一级、二级种子的生长状态 ,比较表达hPK 5蛋白的 4种重组工程菌株在相同条件下的表达情况 ,选出首选发酵种子 ;对其培养时间、诱导时间、培养基种类、pH等条件进行优化 ;并用凝胶成像分析系统对SDS PAGE结果进行分析。结果　经过筛选 ,JM10 9 pBV2 2 0 hPK 5 (简称JP5 )是获取hPK 5蛋白的首选工程菌株 ,其最佳表达条件是LB培养基 (pH 7.4、溶解氧充足 )、30℃培养 3h、4 2℃诱导 6h。在此条件下 ,JP5表达目的蛋白占菌体总蛋白的 38%左右。结论　为高密度发酵获取hPK 5蛋白奠定了实验基础     

重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体质控方法的建立

目的建立重组人组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator,tPA)改构体(TNK-tPA)的质控方法。方法采用气泡法测定TNK-tPA原液的生物学活性,非还原SDS-PAGE和RP-HPLC法测定其纯度,还原型SDS-PAGE确定其相对分子质量,HPLC-SEC法测定其单链含量,胰酶裂解法分析其肽图,Edman降解法测定其N-末端氨基酸序列,毛细管等电聚焦电泳法测定其等电点,Lowrry法测定其蛋白质含量,地高辛法测定其外源DNA残留量。按《中国药典》三部(2005版)要求,对TNK-tPA成品进行鉴别试验及外观、pH值、水分含量、无菌、装量、异常毒性等检测。结果 3批TNK-tPA原液的生物学活性为(2.09～2.16)×106U/ml,比活性均大于3.5×105U/mg,因此确定TNK-tPA原液的比活性不得低于3.0×105U/mg。3批TNK-tPA原液的非还原型SDS-PAGE纯度均大于98.0%,RP-HPLC纯度均大于97.0%;经还原型SDS-PAGE分析可见两条带,相对分子质量分别为68 000和35 000;样品原液的单链含量为75.7%;3批TNK-tPA原液的肽图酶切图谱与理化参考品一致;TNK-tPA原液的N-末端氨基酸序列、等电点、蛋白质含量、外源DNA残留量及成品的鉴别试验结果、外观、pH值、水分含量、无菌、装量、异常毒性等均符合《中国药典》三部(2005版)要求。结论建立的质控方法可保证产品安全、有效、质量可控,可用于TNK-tPA产品的常规检定。     

30L生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂

目的应用30L填充床生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA)。方法将表达rht-PA的CHO细胞株用含10%胎牛血清的IMDM复苏并放大培养,接种至30L生物反应器中,并采用BiocommandPlus软件系统实时监控。先用含血清的培养基生长培养,再更换为无血清培养基进行表达培养。在整个培养过程中,采用灌流培养方式,每日采样测定培养上清中葡萄糖浓度,隔日测定rht-PA的表达水平及生物学活性。采用Lysine-Sepharose4B和Zn2+-Sepharose4B两步亲和层析法纯化rht-PA,并检测纯化产物的比活、产率及纯度。结果整个培养过程持续51d,包括生长培养6d,表达培养45d,平均日灌流量为46.7L,最高达60L,共收获表达培养液约2100L;rht-PA的平均表达水平为15.15mg/L,最高可达19.25mg/L,生物学活性平均约为8000IU/ml;表达培养至第13天时,葡萄糖消耗量达最高水平(15.97g/L·d);纯化的rht-PA比活达6×105IU/mg,产率为63%,纯度达99%以上。结论应用30L填充床生物反应器可实现重组CHO细胞的长时间连续培养及产物rht-PA的高效表达。     

重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)静脉溶栓早期治疗急性脑梗死的疗效

目的观察重组组织纤溶酶原激活剂(rt-PA)静脉溶栓早期治疗急性脑梗死的临床效果和安全性。方法入选的80例急性脑梗死患者随机分为2组,对照组40例给予低分子右旋糖酐、复方丹参注射液、脑细胞活化剂、钙通道阻滞剂、肠溶阿司匹林及甘露醇常规治疗,治疗组在对照组基础上给予rt-PA0.9mg/kg(最大剂量为90mg),先于2min内静注10%,余量60min内静滴[1]。治疗时间为2周。比较2组溶栓前、后神经功能缺损积分(NIHSS)、评价溶栓治疗有效性及安全性。结果溶栓治疗后NIHSS评分明显改善,总有效率为:97.5%,溶栓后合并非症状性脑出血1例,牙龈出血5例。对照组总有效率为82.5%,牙龈出血3例。结论急性脑梗死发病4.5h时间内给予rt-PA(0.9mg/kg)静脉溶栓治疗安全有效。     

重组小纤溶酶的制备及其生物学活性

目的制备重组小纤溶酶,并检测其生物学活性。方法将重组质粒pET11a-miniPlg转化E.coli BL21(DE3),进行诱导表达。收获菌体,提取包涵体,经复性、层析纯化、尿激酶激活,制备小纤溶酶。进行初步理化鉴定后,采用生色底物法测定其体外活性,采用动物模型进行体内溶栓试验,并与重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)进行比较。结果小纤溶酶的表达量约占菌体总蛋白的30%～35%,纯化收率约为15%,得率为4.93mg/g菌体湿重,相对分子质量为38527,N-、C-端氨基酸序列与理论值一致。制备的小纤溶酶比活性为115IU/mg,动物模型溶栓试验中表现出良好的溶栓效果,对纤溶系统和凝血系统影响轻微。结论所制备的重组小纤溶酶具有良好的生物学活性,溶栓效果及安全性均优于rt-PA。     

Stability of the Gossypol-Amine Adducts Used for Chromatographic Measurement of Total and Isomeric Gossypol

The stability of the gossypol amine adducts used for chromatographic determination of gossypol was studied. After extraction and complexation with R-(−)-2-amino-1-propanol, the samples were diluted into an acetonitrile/phosphate buffer solution as described in AOCS Recommended Practice Ba 8a-99. The solutions were then stored under different conditions before being analyzed by reverse-phase chromatography. Samples stored in the dark at −80 °C or at −20 °C showed little change in peak size over 30 days. Samples stored in the dark at −4 °C or at room temperature showed a measurable reduction in gossypol peak size over the study period. Samples stored in the light at room temperature showed the greatest reduction with only 25% of the initial gossypol detectable after 30 days. The rate of degradation followed first-order kinetics. The rate of decrease in gossypol peak size did not differ for the different gossypol matrices studied, i.e., cottonseed kernels, cottonseed meal, or pure gossypol-acetic acid; nor did it differ for the individual gossypol enantiomers. The results indicate that these gossypol Schiff's base adducts can be transported on dry ice before chromatography with minimal concern for their stability.     

氧化物的性能对PVC热稳定性的影响

通过对氧化物的粒度分布和比表面积的测定研究了氧化物表面性能对PVC热稳定性的影响。结果发现,氧化物的粒径大小对PVC动态热稳定性的影响具有决定性的影响,而氧化物的比表面积决定PVC静态热稳定性。     

氧化铝陶瓷膜的制备及热稳定性研究

综述了溶胶－凝胶法制备Ａｌ２Ｏ３陶瓷膜的现状,介绍了Ａｌ２Ｏ３陶瓷的热稳定性及提高其热稳定性的方法,最后展望了Ａｌ２Ｏ３陶瓷膜的发展趋势。     

Exendin-4结构的稳定性及其微球制备

目的分析影响Exendin-4二级结构稳定性的各种因素,并制备Exendin-4微球。方法利用远紫外圆二色光谱(Circular dichroism,CD)技术,分析pH值、温度、高速搅拌、油水界面对Exendin-4二级结构的影响及冰浴和蛋白质保护剂对其二级结构的保护作用。在此基础上,选用乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为成球材料,采用复乳法(W/O/W)制备Exendin-4微球,并对其理化性质进行评价。结果优化了实现Exendin-4二级结构稳定性的药剂学方法。制备的Exendin-4微球流动性良好,球形圆整,平均粒径为(25.3±3.2)μm,结构保持完好,微球的载药量约为1.0%,包封率为72.3%±2.4%,微球的释药曲线符合Higuchi释放模型,未发生明显的突释,具有良好的缓释效果。结论采取适当的药剂学方法,可以保证Exendin-4结构的稳定性并制备出理化性质合格的微球。     

人呼吸道合胞病毒的稳定性

目的观察人呼吸道合胞病毒(HRSV)在不同温度保存、冻融和超声波处理的稳定性。方法将HRSVA2株接种于KMB17细胞上适应培养后,收获病毒液,分别置于37、22、4和-20℃条件下保存不同时间,或经冻融和超声波处理后,用微量细胞病变法检测HRSV的感染性滴度,观察其稳定性。结果HRSV在37℃保存,病毒感染性滴度下降很快,第4天时,降至约1.50lgCCID50/ml,5d后降至1.00lgCCID50/ml以下,几乎检测不到;在22℃保存,病毒感染性滴度下降相对缓慢,第14天时比原始滴度降低约3.20lgCCID50/ml;在4℃和-20℃下保存较稳定,分别保存5周和3个月后,病毒感染性滴度下降<0.60lgCCID50/ml。冻融1、2、3次,病毒感染性滴度分别下降1.37、2.55和3.61lgCCID50/ml,冻融4次后,病毒几乎无感染性。超声波处理后,病毒感染性滴度下降很快,处理1次病毒滴度即下降至原始滴度的50%左右,处理2次后,病毒几乎无感染性。结论HRSV不宜在37℃和22℃存放,可短暂保存于4℃,在-20℃可保存较长时间;冻融和超声波处理均对病毒感染性滴度有明显影响。     

低皂高稳丙烯酸酯单体细乳液的制备Ⅱ.乳液稳定性机理

在前文研究影响丙烯酸酯细乳液稳定性众多因素的基础上 ,测定加分散相前乳化剂与助乳化剂所形成的复合胶束和加分散相后的细乳液的单体液滴粒径大小及乳液水相乳化剂浓度 ,提出在低乳化剂浓度下制备高稳定细乳液的机理 ,并进一步归纳出制备高稳定细乳液的最佳工艺。     

三聚氰胺甲醛树脂包覆红磷的制备及其稳定性研究

为了提高红磷阻燃剂的稳定性,通过原位聚合方法制备三聚氰胺甲醛树脂包覆红磷。通过扫描电镜、马尔文激光粒度仪、p H测试、热重分析仪对包覆前后红磷颗粒进行表征。扫描电镜和马尔文激光粒度仪结果表明,三聚氰胺甲醛树脂可以很好地对红磷颗粒进行包覆。p H值测试显示,与未包覆红磷相比,包覆后的红磷在水下储存稳定性明显提高。热重分析结果说明,包覆红磷可以有效提高红磷的热稳定性,与未包覆红磷相比,包覆红磷的分解温度提高约57℃。同时研究了红磷粒径对包覆红磷性能的影响,包覆红磷随着红磷粒径的降低,热稳定性降低。     

人Cu,Zn-SOD基因在毕赤酵母中的表达及稳定性

目的构建人Cu,Zn-SOD基因的真核表达载体,转化毕赤酵母,并检测表达产物的稳定性。方法根据酵母密码子偏好性,合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9k中,转化毕赤酵母GS115。甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。优化表达条件,并检测粗酶液的稳定性。结果经SDS-PAGE和Western blot检测,表达的目的蛋白相对分子质量为18000左右;最佳表达条件为pH6.0,甲醇浓度1.5%,持续培养96h;目的蛋白占分泌蛋白总量的27%,最高表达量为91mg/L;最佳条件下培养液上清的酶活性最高达334U/ml,粗酶对氯仿和乙醇稳定,对H2O2不稳定,对温度有一定的耐受性,pH在6和8时较稳定。结论在毕赤酵母GS115中成功表达了具备酶活性的人Cu,Zn-SOD基因。     

“人流血”中早孕因子的分离、纯化及鉴定

目的　分离、纯化并鉴定“人流血”中的早孕因子。方法　采用DEAE纤维素离子交换层析 ,S Sepharosefastflow离子交换层析 ,ConA SepharoseCl 4B亲和层析 ,Heparin SepharoseCl 6B亲和层析等方法进行纯化。用花结抑制实验检测出其活性。以SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其肽图。以等电聚焦电泳法检测其等电点。结果　从人流血中分离出EPF活性样物质 ,其蛋白含量为 0 .375mg/ml,SDS PAGE见 1条均匀带 ,其相对分子质量为2 6 5 0 0 ,等电点为 6 .87。结论　本研究提取的早孕因子性质与国内外报道的从妊娠初期孕妇血清中提取的基本一致     

石榴花色素的提取及稳定性研究

以石留花为原料提取石榴花色素,并对影响它提取率的因素:提取剂、提取温度、提取pH值、提取剂用量、提取次数等方面进行大量实验研究,进行分析得出提取石榴花色素的最佳条件为30℃水浴下,pH=1的95%乙醇溶液以1∶8的料液比浸泡1.0 h得到产率较高的色素,从而设计出石榴花色素提取工艺;对色素的耐酸碱性、耐热性、耐光性、耐氧化还原性、及对食品添加剂食盐、蔗糖、柠檬酸等方面进行测定分析得出石榴花色素色泽具有较好的耐光耐热耐还原能力,而对氧化剂适应能力较差,对食品添加剂适应能力较强;最后通过各种金属离子对该色素色泽的影响实验,得出大多数金属离子(除Fe3 、Pb2 )对该色素色泽无影响,从而得出该色素在食品、饮料、糖果及酒类等方面,具有很大的开发应用和前景。