嵌合泛素连接酶TrCP-CC及其突变体△F-CC重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建嵌合泛素连接酶TrCP-CC及其突变体△F-CC的重组腺病毒,并检测其表达。方法采用PCR和重叠PCR法构建真核表达质粒Migr1-TrCP-CC-HA和Migr1-△F-CC-HA,以此为模板,通过PCR将其克隆至穿梭质粒pAd-Track-CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-TrCP-CC和pAdTrack-△F-CC,再与骨架载体pAdeasy-1经同源重组得到重组腺病毒质粒pAd-TrCP-CC和pAd-△F-CC,转染HEK293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒Ad-TrCP-CC和Ad-△F-CC,测定其滴度,并经RT-PCR检测目的基因的转录水平。结果经酶切和测序证实重组腺病毒质粒pAd-TrCP-CC和pAd-△F-CC构建正确,经HEK293细胞包装后显微镜下可观察到绿色荧光,病毒滴度分别为2.5×109和1.0×109pfu/L,经RT-PCR检测目的基因可有效表达。结论已成功构建重组腺病毒Ad-TrCP-CC和Ad-△F-CC,并在HEK293细胞中成功表达,为进一步研究其靶向融合蛋白Bcr-Abl泛素化和降解的机制奠定了基础。     

c-ski基因重组腺病毒质粒的构建及其对肿瘤相关成纤维细胞增殖的影响

目的构建携带c-ski基因的重组腺病毒质粒,并检测其对肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)增殖活力的影响。方法以pcDNA3-c-ski质粒为模板,PCR扩增c-ski基因,与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-c-ski,经PmeⅠ线性化后,转化感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒,经PacⅠ线性化后,转染HEK-293细胞,获得重组腺病毒,经扩增及纯化后测定病毒滴度。将纯化的重组腺病毒感染乳腺癌CAFs,采用Western blot法检测感染细胞中c-Ski蛋白的表达水平;MTT法和细胞计数法检测重组腺病毒对CAFs细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切鉴定证明构建正确;转染HEK-293细胞48 h后可见大量绿色荧光蛋白的表达,纯化的重组腺病毒的滴度为3.11×1010IFU/ml;感染重组腺病毒的乳腺癌CAFs中c-Ski蛋白的表达水平明显高于空病毒组和空白对照组(P<0.001),且增殖活力明显高于空白对照组(P<0.05)。结论成功构建了表达c-ski基因的重组腺病毒质粒,其可明显促进CAFs的增殖,为进一步研究c-Ski对CAFs增殖分化等生物学功能的影响及作用机制提供了实验依据。     

小鼠CX3CR1基因重组慢病毒过表达质粒的构建及鉴定

目的构建小鼠CX3CR1基因重组慢病毒过表达质粒,并对其进行鉴定。方法根据GenBank登录的小鼠CX3CR1基因序列设计引物,PCR扩增CX3CR1基因,将其定向克隆至载体pUbi-MCS-EGFP,经菌落PCR和序列测定,将鉴定正确的重组慢病毒质粒转染293T细胞,显微镜下观察病毒的绿色荧光,并根据荧光表达情况计算转染病毒滴度。结果 CX3CR1基因PCR产物经琼脂凝胶电泳鉴定,可见约1 000 bp的目的条带;经菌落PCR鉴定及序列测定,重组慢病毒过表达质粒pUbi-MCS-CX3CR1-EGFP构建正确,转染293T细胞48 h后,可见绿色荧光表达,经计算,病毒滴度为2×108TU/ml。结论成功构建小鼠CX3CR1基因重组慢病毒过表达质粒pUbi-MCS-CX3CR1-EGFP,为研究慢病毒介导的CX3CR1基因转染骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)及其归巢能力奠定了基础。     

人乳头状瘤病毒16亚型E6E7基因重组腺病毒的构建及其在小鼠骨髓源树突状细胞中的表达

目的 构建人乳头状瘤病毒16亚型(Human papillomavirus 16,HPV16)E6E7基因重组腺病毒,并在小鼠骨髓源树突状细胞(Dendritic cell,DC)中表达。方法双酶切质粒pET-32a(+)-E6E7获得E6E7,基因片段,插入腺病毒穿梭质粒pAd-Track-CMV中,转染HEK293细胞,扩增病毒,经同源重组、包装后获得重组腺病毒pAd-E6E7,转染体外培养的小鼠骨髓源DC,激光共聚焦显微镜观察转染的小鼠DC的形态,流式细胞术检测转染前后小鼠DC表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C),Western blot检测E6蛋白的表达。结果双酶切及测序证实,重组腺病毒质粒pAd-E6E7构建正确,插入的E6E7基因片段序列正确;转染HEK293细胞48 h,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,重组腺病毒的滴度为3×107 CCID50/ml;重组腺病毒pAd-E6E7感染后DC的状态与成熟DC表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C)相符合,感染后的DC表面有许多树枝状、刺状突起,符合成熟DC的表面形态;感染后的DC中存在E6蛋白的表达。结论已成功构建了HPV16 E6E7基因重组腺病毒表达质粒,其能在小鼠骨髓源DC中表达。     

人GINS2基因重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的利用AdEasy系统构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,并进行鉴定。方法以pcDNA3.1-GINS2质粒为模板,PCR扩增GINS2基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2,经双酶切及测序鉴定正确的阳性质粒与骨架质粒pAdEasy-1同时转化感受态大肠杆菌BJ5183,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAdE-GINS2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-GINS2,大量扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。Western blot法检测重组腺病毒感染的人HL60细胞中GINS2蛋白的表达,MTT法检测重组腺病毒感染对HL60细胞增殖的影响。结果重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2经双酶切及测序证明构建正确;经酶切鉴定证明重组腺病毒质粒pAdE-GINS2构建正确;经PCR鉴定证明重组腺病毒Ad-GINS2包装成功,经3轮扩增后病毒滴度可达1.35×1012IU/ml;与空载体感染及未感染的HL60细胞相比,重组腺病毒感染的HL60细胞内GINS2蛋白的表达及细胞增殖水平均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,感染人HL60细胞后可促进其增殖,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

猪卵透明带3α重组腺病毒的构建及纯化

目的构建猪卵透明带3α(pZP3α)重组腺病毒,并包装与纯化病毒,为研究猪ZP3α重组腺病毒避孕疫苗奠定基础。方法将pZP3α基因克隆至穿梭质粒pShuttle,重组穿梭质粒pSshuttle-pZP3α再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-5共转化大肠杆菌BJ5183,筛选重组腺病毒质粒pAd-pZP3α,脂质体法转染HEK293A细胞,包装并扩增病毒至第4代。收集重组病毒颗粒,经两轮氯化铯密度梯度离心纯化,紫外吸收法测定总病毒颗粒数(VP),并计算病毒的颗粒性滴度,空斑形成试验测定病毒的感染性滴度。以MOI为10的病毒剂量感染HeLa细胞,PCR鉴定插入病毒的目的基因,斑点免疫印迹法鉴定目的蛋白的表达。结果pZP3α基因成功插入病毒基因组,pZP3α蛋白能在病毒感染的HeLa细胞中正常表达。病毒的颗粒性滴度约为1.3×1011VP/ml,感染性滴度约为3×109PFU/ml。结论已成功构建猪ZP3α重组腺病毒质粒pAd-pZP3α,包装并纯化了重组pZP3α腺病毒颗粒。     

狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒表达载体,并进行鉴定。方法将狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因克隆至慢病毒载体pLVX-ZsGreen-IRES上,筛选阳性重组克隆。将质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G、包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T包装细胞系,通过荧光显微镜观察报告基因表达情况。收集上清,经浓缩后接种293T细胞,进行重组慢病毒感染细胞的鉴定;用限制性内切酶切除质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G绿色荧光蛋白基因,采用直接免疫荧光试验检测狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。结果重组慢病毒表达载体经酶切和测序证明构建正确。荧光显微镜下可见重组慢病毒感染的293T细胞有大量绿色荧光出现,病毒滴度为3×107 IU/ml;直接免疫荧光检测表明,糖蛋白基因在293T细胞内获得有效表达。结论成功构建了狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒载体,为狂犬病基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

内皮抑素过表达慢病毒载体的构建及其鉴定

目的构建内皮抑素(endostatin,ES)过表达慢病毒载体,并进行鉴定。方法利用载体PUC57-ES构建GV365-ES慢病毒载体,转染293T细胞包装慢病毒,荧光显微镜下观察绿色荧光;Western blot法鉴定表达的目的蛋白;HIV-1 ELISA法检测病毒滴度。结果经PCR及测序鉴定证明慢病毒载体GV365-ES构建正确;转染细胞中荧光显微镜下可见绿色荧光,表达的目的蛋白相对分子质量约23 000;病毒滴度为2.1×10~8 TU/ml。结论已成功构建ES过表达慢病毒载体,为后期该病毒载体治疗实体瘤的观察及其作用机理的研究奠定了基础。     

靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白shRNA慢病毒干扰质粒的构建及鉴定

目的构建靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract-binding protein,PTB)的shRNA慢病毒干扰质粒,并对其进行鉴定。方法根据Gen Bank中登录的PTB的基因序列设计并合成2条靶向MA104细胞PTB基因的shRNA干扰序列(shPTB1、shPTB2)和1条阴性对照序列(shControl),分别插入载体p LVshRNA-EGFP(2A)Puro后,构建慢病毒重组质粒;利用HEK293Ta细胞包装针对PTB基因的shRNA的重组慢病毒颗粒;感染MA104细胞后,经Resl-time PCR、免疫荧光和Western blot法分别检测MA104细胞中PTB基因的转录和蛋白表达水平。结果 PCR及测序鉴定证明3种重组慢病毒质粒构建正确。3种重组慢病毒质粒转染HEK293Ta细胞48 h后,均可见绿色荧光表达,3组细胞的病毒滴度均为2×106 TU/ml。3种重组慢病毒感染MA104细胞48 h后均可见绿色荧光表达。经嘌呤霉素加压筛选后,p LVshPTB1-EGFP-2A和p LVshPTB2-EGFP-2A组MA104细胞仅有少量细胞于细胞核中表达,p LVshPTB1-EGFP-2A组MA104细胞中PTB基因转录及蛋白表达的水平均低于p LVshPTB2-EGFP-2A组。结论成功构建了靶向MA104细胞PTB蛋白的shRNA重组慢病毒,shRNA序列可成功下调PTB在MA104细胞中的表达,为PTB在RV增殖过程中调控作用的研究奠定了基础。     

hepaCAM基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定

目的构建表达肝细胞黏附分子(Hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM)基因的重组腺病毒质粒,并进行鉴定。方法以质粒pEGFP-N2-hepaCAM为模板,PCR扩增hepaCAM基因,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将重组腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-hepaCAM经PmeⅠ线性化,转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。重组腺病毒质粒pAdEasy-1-hepaCAM经PmeⅠ线性化后,转染HEK-293细胞,包装重组腺病毒AdI-hepaCAM,经大量扩增后,检测病毒滴度。RT-qPCR及Westernblot检测感染的BIU-87细胞内hepaCAM的表达。结果酶切鉴定证实重组腺病毒质粒pAdEasy-1-hepaCAM构建正确,重组腺病毒AdI-hepaCAM滴度可达1.6×1012pfu/ml,与空载体腺病毒组比较,经重组腺病毒感染的BIU-87细胞中hepaCAM mRNA及蛋白的表达均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带hepaCAM的重组腺病毒载体AdI-hepaCAM,为研究hepaCAM基因对膀胱癌细胞增殖的调控提供依据。     

重组丙型肝炎病毒腺病毒载体疫苗rAd/E2的构建及鉴定

目的构建含丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)E2基因的复制缺陷型重组腺病毒载体疫苗,并进行鉴定。方法以含HCV(1a亚型)E2基因的质粒pEGFP-HCV/E1E2为模板,PCR扩增E2基因,扩增产物与pGEM-T载体连接,测序正确后双酶切亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/E2,Pme I酶切线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd/E2,PacⅠ酶切线性化后,脂质体LipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞进行包装,获得重组腺病毒rAd/E2,在HEK293细胞内扩增,利用报告基因GFP的表达监测病毒包装及感染效率,PCR、RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,并测定各代病毒的滴度。结果测序结果证明HCV E2基因序列正确;重组腺病毒质粒pAd/E2经酶切证明重组成功;PCR、RT-PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒rAd/E2构建正确;第4代重组腺病毒的滴度为7.5×108 pfu/ml。结论已成功构建了重组HCV腺病毒rAd/E2,为丙型肝炎疫苗的研制提供了新的途径。     

携带人白细胞介素-1受体拮抗剂基因腺病毒质粒的构建

目的构建携带人白细胞介素-1受体拮抗剂(hIL-1Ra)基因重组腺病毒质粒。方法用EcoRⅤ和HindⅢ双酶切质粒pcDNA3-hIL-1Ra,获得hIL-1RacDNA片段,并定向连接在pShuttle-CMV穿梭载体上,构建穿梭质粒pShuttle-CMV/hIL-IRa。经PmeⅠ酶切线性化,穿梭质粒pShuttle-CMV/hIL-1Ra与超螺旋腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,二质粒在细菌内同源重组,得到重组pAd/hIL-1Ra腺病毒质粒。脂质体介导pAd/hIL-1Ra质粒转染HEK293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒,经反复感染HEK293细胞扩增病毒后,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,并测定病毒颗粒数、纯度及滴度。结果经PCR鉴定、限制性酶切分析及序列测定,证明已正确构建重组pShuttle-CMV/hIL-1Ra穿梭质粒和重组pAd/hIL-1Ra腺病毒质粒。扩增纯化后,重组腺病毒颗粒数为1.19×1011OPU/ml,A260/A280为1.279,滴度为3.6×109CCID50/ml。结论已成功构建重组腺病毒质粒pAd/hIL-1Ra,为hIL-1Ra基因在腺病毒载体介导下的免疫抑制治疗研究奠定实验基础。     

应用AdMax系统构建携带HCV核心基因Core的重组腺病毒载体

目的应用AdMax系统构建携带丙型肝炎病毒(HCV)核心基因Core的重组腺病毒载体,为进一步研究防止HCV感染的基因疫苗和基因治疗奠定基础。方法RT-PCR法从丙型肝炎患者血清中扩增HCVCore基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-Core,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pAd-Core,经HEK293细胞扩增后,离子交换柱层析法纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度,并计算比活性及单细胞产量。结果重组腺病毒pAd-Core感染的HEK293细胞经PCR检测,可扩增出HCV核心基因Core片段,经测序证明,其插入序列与设计的HCV Core基因序列一致。扩增纯化后,重组腺病毒的比活性达0.034IU/VP,单细胞产量可达2.63×104VP/细胞。结论已成功构建重组腺病毒载体pAd-Core,为Core基因在腺病毒介导下的基因免疫和基因治疗的研究奠定了基础。     

人S100A8重组腺病毒质粒的构建及鉴定

目的构建人S100A8(hS100A8)重组腺病毒质粒,为hS100A8的深入研究奠定基础。方法从pGST-hS100A8中扩增hS100A8片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A8。经酶切、PCR及测序鉴定,再经PmeⅠ酶切线性化后电转化感受态AdEasier细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A8,经PacⅠ酶切后转染至HEK293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定。结果重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A8及腺病毒质粒pAdhS100A8经鉴定均构建正确;重组腺病毒AdhS100A8在HEK293中成功包装,扩增后病毒滴度为1011 IU/ml;hS100A8在HEK293细胞中成功表达。结论成功构建了hS100A8重组腺病毒质粒,为深入研究hS100A8奠定了基础。     

人巨细胞病毒gB基因真核表达载体的构建与鉴定

目的　克隆人巨细胞病毒 (HCMV)gB基因并构建真核表达载体。方法　根据Genebank中HCMV核苷酸序列设计引物 ,并在引物的 5′端分别加入BamHⅠ、XhoⅠ限制性内切酶位点 ,特异性扩增gB编码基因片段。TA克隆后经双酶切、PCR、测序等鉴定重组质粒 ,再经双酶切、连接构建含HCMVgB编码基因的真核表达载体 ,转染COS7细胞 ,通过间接免疫荧光法 (IFA)检测该重组真核表达载体在COS7细胞中的表达。结果　重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成大小为 5 0kb与 2 7kb的片段 ,表明表达载体pcDNA3 1中插入了HCMVgB基因片段 ,测序结果表明读码框正确。重组表达载体pcDNA3 1 gB转染COS7细胞后 ,经IFA检测胞浆中可见黄绿色荧光。结论成功构建了pcDNA3 1 gB真核表达载体 ,并可在COS7细胞中表达     

抗菌肽PR-39重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的构建抗菌肽PR-39(Proline-arginine rich 39-amino acid peptide,PR-39)重组腺病毒表达质粒。方法从含抗菌肽PR-39核心编码区的质粒中扩增PR-39基因,亚克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组穿梭质粒,经PmeⅠ酶切线性化后,转化感受态AdEasier细胞,构建重组腺病毒质粒,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度检测。将重组腺病毒感染鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2,通过荧光显微镜观察红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)的表达,RT-PCR法检测PR-39基因的转录水平。结果重组腺病毒穿梭质粒pAd-Trace-TO4-PR-39经KpnⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组腺病毒质粒pAdPR-39经PacⅠ酶切鉴定,证明目的基因已整合到腺病毒基因组中;第4代重组腺病毒AdPR-39的病毒滴度为1010IU/ml;感染重组腺病毒AdPR-39的C3H10T1/2细胞可表达RFP;PR-39基因在C3H10T1/2细胞内成功转录。结论已成功构建携带RFP的PR-39重组腺病毒表达质粒,在鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2中可高效表达。     

携带人6Ckine/IFNγ融合基因腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建携带人次级淋巴组织趋化因子(6Ckine)和γ-干扰素(IFNγ)融合基因的重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNγ,并在真核细胞中表达。方法RT-PCR法分别从人淋巴结和外周血单个核细胞中扩增人6Ckine cDNA和IFNγ cDNA,分两步先后将6Ckine cDNA和IFNγ cDNA连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,二者之间以XbaⅠ酶切位点相连,应用AdMax腺病毒包装系统在HEK293细胞内同源重组,构建重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNγ,经扩增和纯化后感染真核细胞HepG2,并检测6Ckine/IFNγ融合蛋白的表达。结果所构建的重组腺病毒Ad-6Ckine/IFNγ经扩增和纯化后,滴度为1.26×1010IFU/ml。PCR法鉴定无野生型腺病毒的污染,所携带的6Ckine/IFNγ融合基因能在真核细胞中得到表达,表达形式为分泌型。结论已成功构建重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNγ,并在真核细胞中表达,为进一步研究肿瘤的基因和免疫治疗奠定了基础。     

重组腺病毒Ad5/F35-HF2S的构建及其鉴定

目的构建携带HA标签的重组腺病毒Ad5F35-HF2S。方法体外合成HA标签DNA双链,以K562细胞cDNA为模板,分别扩增FKBP1、FKBP2和SH2基因,依次亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV-HA中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HF2S,穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化,与腺病毒骨架质粒pAd5/F35在Ad5/F35-BJ5183感受态细胞中同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd5/F35-HF2S,经PacⅠ酶切线性化后,转染AD-293细胞进行包装、扩增,获得重组腺病毒Ad5/F35-HF2S,经2轮扩增后,测定病毒滴度;采用PCR及Western blot法检测感染细胞中HF2S基因的转录及蛋白的表达。结果重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HF2S及重组腺病毒质粒pAd5/F35-HF2S经鉴定均构建正确;经包装及2轮扩增后,重组腺病毒Ad5/F35-HF2S病毒滴度可达1013IU/ml;经PCR及Western blot鉴定表明,重组腺病毒携带的HF2S基因能够在AD-293细胞中表达。结论已成功构建了表达HF2S基因的重组腺病毒Ad5/F35-HF2S,为研究Grb2-SH2结构域在CML中的基因治疗和作用机制奠定了基础。