带有丝素重链信号肽序列的家蚕丝胶蛋白启动子驱动DsRed的瞬时分泌表达

为了探讨家蚕Bombyxmori丝素蛋白重链信号肽序列在中部丝腺组织中是否具有功能活性,根据家蚕丝蛋白基因的启动子活性高、丝蛋白具有高效分泌的特性,构建了带有丝素重链基因fib-H信号肽的家蚕丝胶-1(ser-1)启动子(ser-HS),用ser-HS驱动DsRed基因构建了分泌型瞬时表达载体pSK-SerHS-DsRed-polyA。转染细胞实验显示,该载体能在家蚕BmN细胞中瞬时表达DsRed。家蚕注射载体后,可在中部丝腺腔中检测到红色荧光,表明瞬时表达的DsRed已分泌到丝腺腔内。据此提出克隆的fib-H信号肽序列在家蚕中部丝腺组织中具有信号肽的功能。     

带有丝素重链信号肽序列的家蚕丝胶蛋白启动子驱动DsRed的瞬时分泌表达

为了探讨家蚕Bombyxmori丝素蛋白重链信号肽序列在中部丝腺组织中是否具有功能活性,根据家蚕丝蛋白基因的启动子活性高、丝蛋白具有高效分泌的特性,构建了带有丝素重链基因fib-H信号肽的家蚕丝胶-1(ser-1)启动子(ser-HS),用ser-HS驱动DsRed基因构建了分泌型瞬时表达载体pSK-SerHS-DsRed-polyA。转染细胞实验显示,该载体能在家蚕BmN细胞中瞬时表达DsRed。家蚕注射载体后,可在中部丝腺腔中检测到红色荧光,表明瞬时表达的DsRed已分泌到丝腺腔内。据此提出克隆的fib-H信号肽序列在家蚕中部丝腺组织中具有信号肽的功能。     

带有丝素重链信号肽序列的家蚕丝胶蛋白启动子驱动DsRed的瞬时分泌表达

为了探讨家蚕Bombyxmori丝素蛋白重链信号肽序列在中部丝腺组织中是否具有功能活性,根据家蚕丝蛋白基因的启动子活性高、丝蛋白具有高效分泌的特性,构建了带有丝素重链基因fib-H信号肽的家蚕丝胶-1(ser-1)启动子(ser-HS),用ser-HS驱动DsRed基因构建了分泌型瞬时表达载体pSK-SerHS-DsRed-polyA。转染细胞实验显示,该载体能在家蚕BmN细胞中瞬时表达DsRed。家蚕注射载体后,可在中部丝腺腔中检测到红色荧光,表明瞬时表达的DsRed已分泌到丝腺腔内。据此提出克隆的fib-H信号肽序列在家蚕中部丝腺组织中具有信号肽的功能。     

带有丝素重链信号肽序列的家蚕丝胶蛋白启动子驱动DsRed的瞬时分泌表达

为了探讨家蚕Bombyxmori丝素蛋白重链信号肽序列在中部丝腺组织中是否具有功能活性,根据家蚕丝蛋白基因的启动子活性高、丝蛋白具有高效分泌的特性,构建了带有丝素重链基因fib-H信号肽的家蚕丝胶-1(ser-1)启动子(ser-HS),用ser-HS驱动DsRed基因构建了分泌型瞬时表达载体pSK-SerHS-DsRed-polyA。转染细胞实验显示,该载体能在家蚕BmN细胞中瞬时表达DsRed。家蚕注射载体后,可在中部丝腺腔中检测到红色荧光,表明瞬时表达的DsRed已分泌到丝腺腔内。据此提出克隆的fib-H信号肽序列在家蚕中部丝腺组织中具有信号肽的功能。     

咪唑类化合物--金鹿三眠素对天蚕幼虫丝腺超微结构的影响

本文报告了咪唑类化合物－－金鹿三眠素对天蚕Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｙａｍａｍａｉ幼虫丝腺超微结构的影响。经处理诱导所得三眠蚕幼虫的丝腺长度、直径及重量在四龄第３天后急剧增长,四龄第９天达到最高值。后部丝腺细胞中粗面内质网十分发达,丝素蛋白小球在高尔基体中形成,在细胞端部靠胞吐作用将丝素蛋白分泌到丝质最后形成丝素纤维团穿过内膜和到腺腔中。丝胶小球在中部丝腺细胞的高尔基体中形成,以相似方式释放入腺腔。丝腺     

人白细胞介素12双亚基共表达pVAX1-IRES-hIL12载体的构建与表达

目的构建下游可以共表达人白细胞介素12(hIL12)双亚基的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12。方法通过搭桥PCR获得人白细胞介素12P35及P40双亚基的融合基因P35-F2A-P40,插入DNA疫苗载体pVAX1-IRES的下游,瞬时转染293-T细胞,ELISA检测融合基因的表达。结果酶切鉴定和序列分析表明融合基因与设计完全一致,融合基因在体外细胞培养液检测中获得分泌表达。结论该载体的成功构建可以为肿瘤基因疫苗研制提供免疫增效载体。     

人二型大麻受体基因的pIRES2-EGFP质粒的构建及其真核表达

目的：构建含有人二型大麻素受体（CB2）基因的真核表达载体,并实现其在HEK293细胞的表达。方法：首先采用PCR方法从含有CB2基因的质粒pcDNA3.1（＋）-CB2中扩增获得人的CB2基因,再采用基因重组技术将CB2的DNA片段插入真核表达载体pIRES2-EGFP。将获得的pIRES2-EGFP-CB2重组子转染HEK293细胞,应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况,RT-PCR和报告基因检测CB2的表达情况。结果：酶切和测序结果验证真核表达载体pIRES2-EGFP-GB2构建成功。可在荧光显微镜下观察到转染HEK293细胞表达的绿色荧光;RT-PCR和双荧光素酶报告基因法检测证明CB2蛋白在真核细胞中成功表达;CB2受体激动剂JWH-015能显著逆转腺苷酸环化酶激动剂forskolin诱发的荧光素酶活性增加。结论：成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-CB2,为进一步研究CB2基因的生理学和病理生理学功能及调控机制奠定了实验基础。     

人PSCA真核表达载体的构建及表达

目的构建含有信号肽及FLAG标签的人前列腺干细胞抗原(PSCA)真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得SIG-FLAG基因片段及人PSCA基因片段,插入到真核表达载体pIRES-neo中。构建的重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及RT-PCR方法检测其表达情况。结果PCR扩增出的SIG-FLAG及PSCA基因测序正确,酶切鉴定证明重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA构建成功;检测结果显示重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA,且在293T细胞中能有效表达,为后续转人PSCA基因细胞系的构建工作奠定了基础。     

慢病毒载体转染离体兔角膜基质细胞的实验研究

目的：观察慢病毒载体转染离体兔角膜基质细胞的有效性及对细胞活性的影响。方法：转染组用慢病毒携带增强型绿色荧光蛋白（Lentivirus-enhanced green fluorescent proteins,Lenti-EGFP）转染细胞,对照组则加入空白培养液,在不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）及感染后不同时间段在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况并计算转染率;RT-PCR检测EGFP mRNA的表达;MTT比色法和流式细胞技术（Flow cytometer,FCM）检测病毒对细胞增殖和凋亡的影响。结果：Lenti-EGFP转染细胞后从48h开始可见绿色荧光,在MOI=500时,转染后第5天转染率可达51%;RT-PCR检测转染组有EGFP的mRNA表达;MTT结果显示在MOI为1~500时,漫病毒不影响细胞的增殖;在MOI=500时,FCM检测慢病毒载体对细胞凋亡无影响。结论：慢病毒载体可以在体外稳定有效转染兔角膜基质细胞且不影响细胞活性,是角膜基质细胞理想的基因转染载体。     

中性纤维素酶β-葡萄糖苷酶基因的克隆表达及酶活测定

本实验以一株产胞外中性纤维素酶的菌株芽孢杆菌CY110为研究对象,以麸皮为诱导物发酵获得了纤维素酶的限速酶组分-β-葡萄糖苷酶,酶的总活力和比活力分别达到了10568U和557．4U／mg,将产物分离纯化后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,在43kDa处得到了单一条带。利用RT-PCR方法从芽孢杆菌CYll0中克隆出β-葡萄糖苷酶基因,将此目的基因连接到pBS-T载体后导入大肠杆菌DH5α,测序得到的阳性克隆以载体pET-28a为表达质粒构建出重组质粒并转化到表达菌株BL21（DE3）中。IPTG诱导表达外源基因后测定酶活并对比原始发酵酶活。结果显示：目的基因大小为1398bp,该序列与GenBank中的β-葡萄糖苷酶基因ABQL01000004．1序列相比同源性达到99％,氨基酸序列同源性达到98％,将产物与pET-28a表达载体连接,经双酶切检验,证明原核表达载体构建成功。诱导表达后的β-葡萄糖苷酶比活力为370．21U／mg,高于原始发酵产生的β-葡萄糖苷酶比活力8％。     

神经调节因子对ErbB2非过表达乳腺癌细胞侵袭转移的作用

目的:探讨在ErbB2非过表达乳腺癌细胞MDA-MB-231 中,神经调节因子(neuregulins,NRGs)对ErbB2受体信号转导活化和侵袭转移能力的作用.方法:免疫细胞化学法和Western blot检测MDA-MB-231细胞中neuregulin(NRG)的表达o应用ErbB2受体功能抑制剂AG825处理MDA-MB-231,MTT法检测细胞的增殖抑制作用:Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭和迁移实验;明胶酶谱实验检测MMP-2、MMP-9的活性.Westem blot检测MMP-2、HIF-1α蛋白表达.结果:神经调节因子在乳腺癌细胞MDA-MB-231呈显著表达,Western blot实验可见分子量44KD的NRG抗体阳性反应条带.应用ErbB2受体功能抑制剂AG825后,MDA-MB-231细胞生长受到抑制,作用呈时效量效依赖关系(P<0.01);细胞的侵袭、迁移能力均明显下降(P<0.05),MMP-2,MMP-9的活性降低(P<0.05);MMP-2、HIF-1α蛋白表达减少(P<0.05).结论:ErbB2非过表达乳腺癌细胞MDA-MB-231存在神经调节因子分泌,可能通过神经调节因子自分泌或旁分泌作用方式使ErbB2受体信号转导处于激活状念,从而影响细胞侵袭转移能力.     

增强型绿色荧光蛋白基因转染对原代培养的人成纤维细胞细胞周期的影响

目的:观察转染增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因后对原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞周期的变化,建立原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞的示踪方法.方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,采用电转仪将pEGFP-N1质粒转入原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,应用荧光显微镜观察其转染过程及瞬时表达情况,流式细胞仪检测其转染效率和细胞周期的变化.结果:增强型绿色荧光蛋白基因在转染24h后得到了明显表达,48h后流式细胞仪检测其表达率为32.6%,细胞周期无明显的变化,且未影响成纤维细胞的贴壁过程.结论:经pEGFP-N1质粒转染的原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞仍能在体外存活,对成纤维细胞的生长没有明显的影响.pEGFP-N1是转染原代培养的人成纤维细胞较为理想的瞬时表达载体,是研究成纤维细胞生物学行为的良好示踪剂.     

重组人骨形态发生蛋白9和2体外诱导成骨的活性分析

利用PCR扩增hBMP-9全长序列构建真核表达载体pcDNA4／HisMax—BMP-9,与质粒pSV2-dhfr共转染CHO—dhfr-细胞,以含有100μg／ml博来霉素的1MDM进行选择性培养,筛选抗性克隆,并用MTX扩增,提高rhBMP-9的表达量。经过细胞分离培养,得到稳定表达rhBMP-9的6株单克隆细胞株,ELISA法检测rhBMP-9表达水平,最高可达1．13μg/24h／10^6cells。收集最高表达蛋白的单克隆株培养基上清,经His标签的蛋白纯化柱纯化,冻干法浓缩得到100μm/ml的rhBMP-9。用浓度100μg／ml的rhBMP-9和rhBMP-2分别刺激培养C3H10,各项成骨指标显示rhBMP-9具有-定的体外诱导成骨能力,但不及rhBMP-2。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对人子宫内膜癌JEC细胞生长及形态影响的研究

目的:通过DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人子宫内膜样癌JEC细胞(中分化)中p57^kip2基因启动子区去甲基化干预,研究5-Aza-CdR对JEC细胞生长抑制及形态改变的影响。方法:Ⅰ.用亚硫酸氢盐测序PCR (BSP)法检测不同浓度5-Aza-CdR干预后JEC细胞中p57^kip2基因启动子区甲基化状态。Ⅱ.将实验组分为12.5μmol·L^-1组、12.5μmol·L^-1组(48h换液时追加一次5-Aza-CdR),对照组不加任何浓度的5-Aza-CdR:(1)干预24 h、72 h,倒置显微镜下观察各组细胞的生长情况。(2)干预72 h,电镜观察各组细胞的超微结构改变情况。结果:Ⅰ. JEC细胞中p57^kip2基因启动子区甲基化水平:未加药组(0μmol·L^-1)p57^kip2基因启动子区呈高甲基化状态(88.1%),12.5μmol·L^-1组总体甲基化率最低(76.2%)。Ⅱ. JEC细胞的生长情况及形态改变情况:(1)光镜:对照组JEC细胞呈多角形或不规则形,梁索状、巢团状、小巢状或散在分布,局部形成微腺泡样结构。随着培养时间的延长,细胞密度逐渐增加,微腺泡样结构更加明显。与对照组比较,干预24 h后,两实验组细胞密度均有所减少;干预72 h后,12.5μmol·L^-1组细胞密度仅比对照组略有减少,12.5μmol·L^-1组细胞密度比对照组明显稀少。(2)电镜:对照组JEC细胞呈不规则形,表面可见短小的微绒毛;胞质内可见线粒体、粗面内质网、分泌泡、脂滴和自噬溶酶体等结构;胞核不规则形,以常染色质为主,可见篮网状核仁,偶见核分裂像及凋亡的细胞。干预72 h后,两实验组细胞表面微绒毛均较对照组增多,胞质内分泌泡、自噬溶酶体增多,扩张的内质网腔内充满合成的蛋白质,未见线粒体肿胀,12.5μmol·L^-1组比12.5μmol·L^-1组的结构改变更明显。结论:5-Aza-CdR可下调人子宫内膜样癌JEC细胞中抑癌基因p57^kip2启动子区甲基化水平,从而发挥其抑制JEC细胞生长与增殖的作用,还可使细胞向较好的分化方向转化;浓度为12.5μmol·L^-1的5-Aza-CdR对JEC细胞不具备细胞毒性作用,追加用药比单纯一次用药对JEC细胞生长与增殖的抑制的效果更好。     

烟夜蛾性信息素结合蛋白2(PBP2)基因的克隆、序列分析与时空表达

性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)在昆虫雌雄间信息交流中起着重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE方法,从烟夜蛾Helicoverpa assulta(Guen&#233;e)雄虫触角中克隆了性信息素结合蛋白2基因的开放阅读框及3′末端序列,该基因被命名为HassPBP2(GenBank登录号为EU316186)。克隆和测序结果表明,HassPBP2开放阅读框全长450bp,编码149个氨基酸残基,推测编码蛋白的分子量为16.9kD,等电点为5.56。HassPBP2基因结构分析表明,该基因由3个外显子和2个内含子组成,内含子的长度分别为90和261bp。氨基酸序列联配分析表明,此序列具有气味结合蛋白的典型特征,与其他鳞翅目昆虫PBPs的一致性在34%~91%之间,其中与棉铃虫Helicoverpa armigeraPBP2和烟芽夜蛾Heliothis virescensPBP2的序列一致性高达91%。时间表达和组织表达分析显示,HassPBP2在卵期、幼虫期和蛹早期不表达,在蛹中期开始表达,并一直持续到成虫中期,且只在雌、雄成虫触角中表达。     

烟夜蛾性信息素结合蛋白2(PBP2)基因的克隆、序列分析与时空表达

性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)在昆虫雌雄间信息交流中起着重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE方法,从烟夜蛾Helicoverpa assulta(Guen&#233;e)雄虫触角中克隆了性信息素结合蛋白2基因的开放阅读框及3′末端序列,该基因被命名为HassPBP2(GenBank登录号为EU316186)。克隆和测序结果表明,HassPBP2开放阅读框全长450bp,编码149个氨基酸残基,推测编码蛋白的分子量为16.9kD,等电点为5.56。HassPBP2基因结构分析表明,该基因由3个外显子和2个内含子组成,内含子的长度分别为90和261bp。氨基酸序列联配分析表明,此序列具有气味结合蛋白的典型特征,与其他鳞翅目昆虫PBPs的一致性在34%~91%之间,其中与棉铃虫Helicoverpa armigeraPBP2和烟芽夜蛾Heliothis virescensPBP2的序列一致性高达91%。时间表达和组织表达分析显示,HassPBP2在卵期、幼虫期和蛹早期不表达,在蛹中期开始表达,并一直持续到成虫中期,且只在雌、雄成虫触角中表达。     

乙型肝炎病毒前-S2蛋白反式激活蛋白1基因的克隆化研究

目的应用基因表达谱芯片技术及生物信息学技术筛选并克隆乙型肝炎病毒（HBV）前-S2蛋白反式激活新型靶基因，进一步阐明HBV感染相关性疾病的发病机制。方法以HBV前-S2蛋白表达质粒pcDNA3．1（-）-PreS2转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为平行对照，提取总RNA进行基因表达谱芯片分析。并克隆HBV前-S2反式激活作用的新的靶基因。结果获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被前-S2蛋白反式激活，故命名为前S2反式激活蛋白1（PS2TP1），已在GenBank中注册，注册号：AY561706。PS2TP1基因的编码序列全长为1113个核苷酸（nt），编码产物由370个氨基酸残基（aa）组成。结论HBV前-S2蛋白具有反式激活功能，调节宿主细胞某些基因的表达，从而改变宿主正常的应答水平，引起病变。     

鼠重组腺病毒介导的骨形成蛋白-9转染大鼠牙囊干细胞的实验研究

目的：探讨鼠重组腺病毒介导的骨形成蛋白9基因转染大鼠牙囊干细胞的可行性及其转染后的成骨作用,以获得可用于牙周骨组织再生工程的基因修饰的种子细胞。方法：取大鼠下颌骨,解剖显微镜下体外分离培养纯化鉴定牙囊干细胞,腺病毒介导的骨形成蛋白9基因转染第三代牙囊干细胞,并设立空白对照组,绿色荧光病毒组（GFP组）。通过观察细胞形态及生长曲线变化,荧光显微镜及RT—PCR检测转染后骨形成蛋白9基因mRNA的表达,碱性磷酸酶及钙茜素红染色测定转染后牙囊干细胞的成骨活性。结果：与未转染对照组比较,转染组细胞转染2周后形成钙化结节,停滞期延长,数量轻度下降,倍增时间延长。牙囊干细胞转染骨形成蛋白9基因后12h后即有荧光表达,转染3,6,9,12d后骨形成蛋白9mRNA均呈阳性表达且逐渐增强,未转染对照组呈阴性。转染组碱性磷酸酶活性随转染时间的延长呈升高趋势,ALP染色及茜素红钙结节染色为阳性：未转染对照组碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色均呈弱阳性表达,转染组显著高于未转染组。结论：鼠重组腺病毒介导的RBMP-9基因可以成功地转染大鼠牙囊干细胞,转染后牙囊干细胞高表达骨形成蛋白9,且具有明显的成骨作用。     

电穿孔法转染原代培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的条件优化

目的:通过电穿孔法将增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体pEGFP-N1质粒导入原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,探讨影响外源基因电转染效率的参数,如电压、脉冲长度、DNA剂量以及转染后时间长度等.方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,选择不同的电压梯度、脉冲长度及DNA剂量,采用电转仪将pEGFP-N1质粒导入原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,用荧光显微镜观察转染后不同时间pEGFP-N1瞬时表达情况及细胞存活情况,流式细胞仪检测其转染效率.结果:在电压为250v、脉冲数1、脉冲长度15μs、DNA质粒6μg时,电穿孔法将pEGFP-N1质粒导入瘢痕疙瘩成纤维细胞转染率最高,细胞存活率最高,转染后24h明显表达,48h后表达最强.结论:在适当的电压、脉冲长度下,选择适当的DNA用量,在转染后一定的时间范围内,电穿孔法转染原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞可使目的基因获得较高的转染率,且细胞死亡最少.电穿孔法是研究原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学行为较为理想的转染方法.     

蚕豆萎蔫病毒2号VP37蛋白在BY-2细胞内的定位

将绿色荧光蛋白（GFP）连接于蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus2,BBWV-2）VP37蛋白的N-端,构建融合基因GFP-VP37,用农杆菌法在BY-2悬浮细胞内进行表达,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的分布。结果显示：GFP-VP37主要定位于细胞核的周围呈网络状,并在细胞边缘形成点状结构;ER-tracker标记显示VP37在细胞内与内质网共定位;电镜免疫金标记显示VP37蛋白主要定位在细胞质中;用BFA处理转染细胞后,VP37在细胞质及细胞边缘的定位受到抑制。推测内质网参与VP37的细胞内转运和分布。