生物柴油中游离甲醇的测定

采用紫外可见分光光度法,建立了准确测定生物柴油中游离甲醇含量的方法。试验结果表明:甲醇在0~103.6μg/25 ml浓度范围内具有良好的线性关系(R>0.997),回收率为95.2%~97.4 %,精密度试验的变异系数CV小于0.395 %。此方法准确度高,重复性好。     

火焰光度法测定载体氧化铝中钠含量

研究了钯催化剂载体氧化铝中微量钠的火焰光度法测定,确定了较适宜的测定条件,其Na~+的检出浓度为0.1μg/ml,线性范围为1.0～36μg/ml。方法简便快速、准确度高,精密度好,回收率为96.4％～100.6％,最大变异系数为0.7％。     

微分电位溶出法测定儿童头发中锌和铅的含量

采用微分电位溶出法测定了100名(男女各50名)3～10岁健康儿童头发中锌和铅的含量。结果表明,锌平均含量为(135.1±57.86)μg/g,铅平均含量为(11.89±7.42)μg/g。该方法准确度、精密度高,锌、铅测定的相对标准偏差分别为3.8%和8.2%,回收率分别为93.8%和103.5%。     

吸附无细胞百白破联合疫苗中游离甲醛含量柱前衍生反相高效液相色谱检测方法的建立及验证

目的建立检测吸附无细胞百白破联合疫苗中游离甲醛含量的柱前衍生反相高效液相色谱法,并进行验证。方法以2,4二硝基苯肼(DNPH)为衍生剂,采用ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以70%乙睛溶液为流动相进行等度洗脱,流速为1 ml/min,检测波长为360 nm,进样量为10μl。对该方法的专属性、线性范围、精密度、准确度进行验证。用建立的方法检测10批吸附无细胞百白破联合疫苗中的游离甲醛含量。结果DNPH、甲醛、戊二醛的保留时间分别为3.148、4.178和11.058 min,甲醛的拖尾因子为1.07,与戊二醛的分离度为26.8;甲醛浓度在20~100μg/ml范围内,与峰面积呈良好的线性关系,相关系数(r)为0.998 3;同一人员连续重复检测6次结果的相对标准偏差(RSD)为0.5%,2名人员于不同时间重复检测6次结果的RSD为0.6%;9份加标供试品溶液甲醛含量的回收率为101.0%~106.0%。10批吸附无细胞百白破联合疫苗中的游离甲醛含量均符合规定。结论建立的柱前衍生反相高效液相色谱法具有良好的精密度及准确性,可用于测定吸附无细胞百白破联合疫苗中的游离甲醛含量。     

测定含甘油牛血清白蛋白样品Lowry法的优化及验证

目的优化《中国药典》三部(2015版)通则50中Lowry法2试验条件,进一步提高检测结果的准确性,并进行方法学验证,为柱纯化组分百日咳疫苗中间品蛋白准确定量提供参考。方法用Lowry法2测定经脱氧胆酸钠-三氯乙酸预处理的不同浓度且含50%甘油的牛血清白蛋白,使福林酚反应在20℃水浴条件下分别静置30、40和50 min,筛选出蛋白含量测定值相对误差最小的反应时间;再在10、20和30℃条件下,筛选出相对误差最小的反应温度。对该方法进行精密度、准确度、专属性验证,并确定线性范围。结果福林酚反应温度为30℃、反应时间为30 min时,测定值的平均相对误差最低,与其他试验条件的差异有统计学意义(P0.05)。在该试验条件下,同一工作日不同试验人员间及同一试验人员不同工作日检测结果的RSD均小于2.00%,重复性检测结果 RSD为0.50%,精密度良好;30、50和70μg/m L蛋白溶液测定值的RSD均小于2.00%,回收率在99%~102%之间,可对蛋白准确定量;含甘油50μg/m L蛋白溶液的回收率及其RSD分别为102%和0.50%;不含甘油对照组回收率和RSD分别为100%和0.82%,专属性良好;在0~140μg/m L标准范围内,检测含甘油样品的测定范围在15~140μg。结论采用Lowry法2测定含高浓度甘油的蛋白样品时,福林酚反应温度、反应时间是影响试验结果的重要因素。30℃条件下反应30 min,可提高测定结果的准确性,符合且更有利于柱纯化组分百日咳疫苗中间品的蛋白定量的要求。     

冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗中各群多糖含量检测方法的建立及验证

目的建立冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗中多糖含量的测定方法。方法将10支ACYW135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗用注射用水复溶后,分为10份,70μl/份,依次加入20 mg/ml蛋白酶K溶液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9μl,降解结合物中载体蛋白,采用火箭免疫电泳法进行多糖含量的测定,确定蛋白酶K最适加量。对建立的方法进行线性范围、定量限度确定以及准确度、精密性及专属性验证。结果 20 mg/ml蛋白酶K的最适加量为5μl;该方法的线性范围为2.5~40μg/ml,定量限度为2.5μg/ml;3个不同浓度的供试品重复测定3次,A、C、Y、W135群多糖含量的平均回收率分别为99.1%、96.5%、96.5%和97.4%;不同试验人员在不同时间对同一供试品重复测定9次,A、C、Y、W135群多糖含量的CV值分别为3.40%、4.11%、3.35%和4.88%;各群多糖抗原均与其对应的抗血清产生免疫沉淀,而与其他群抗血清不产生免疫沉淀,具有较强的特异性。结论建立了冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗中多糖含量的检测方法,该方法在确定的限度范围内具有较好的准确度、精密性及专属性。     

壳聚糖含量紫外分光光度检测方法的建立及验证

目的建立检测壳聚糖(chitosan,CTS)含量的紫外分光光度法,并进行验证。方法通过对反应体系溶液及标准曲线稀释倍数的优化,建立紫外分光光度法检测CTS含量,并对该方法进行专属性、线性范围、准确度、精密度(重复性、中间精密度)及耐用性验证。结果确定以0.2%乙酸溶液作为反应体系溶液,2倍系列稀释作为标准曲线的稀释倍数。该方法检测0.2%乙酸溶液组CTS的回收率为8.07%,而CTS溶液组的回收率可达101.38%;该方法的线性范围为0~62.5μg/ml;CTS溶液浓度在25.0~75.0μg/ml之间,该方法具有良好的准确度;重复性、中间精密度及耐用性检测结果的变异系数(CV)均20%。结论建立了CTS含量紫外分光光度检测方法,该方法具有良好的专属性、重复性及中间精密度,且在25.0~62.5μg/ml具有良好的准确度,0~62.5μg/ml具有良好的线性。     

酶标板法检测甘油三酯净含量方法的优化、验证及其在人血白蛋白层析纯化工艺中的应用

目的优化酶标板法检测甘油三酯(triglyceride,TG)净含量的方法,进行验证,并将其应用于监测人血白蛋白层析纯化工艺中样品的脂类含量,对工艺优化提供指导。方法建立酶标板上快速检测TG含量方法,通过两步酶反应的吸光度值的差值计算TG净含量。确立该方法的标准曲线范围,并进行准确度和精密度进行验证。采用该方法监测层析工艺中样品的TG净含量,优化人血白蛋白层析纯化工艺。结果该方法检测TG的线性范围在78~2 500μg/ml之间,游离甘油(free glycerin,FG)的线性范围在8.13~260μg/ml之间,R2均为0.997。各样品检测结果 CV均4%,回收率在102%~107%之间,准确度较好;同一样品由同一个实验员在同一试验中连续测定6次和由不同的实验员在不同日期内分别测定3次的结果,CV均3%,精密度较好。在人血白蛋白层析纯化工艺中采用去脂剂可将白蛋白样品中的残余脂类去除。结论优化后的甘油三酯净含量检测方法为人血白蛋白层析纯化工艺的优化提供了指导,在血液制品工艺研发过程中具有重要的应用价值。     

反相高效液相色谱法测定注射用重组人干扰素β1b中干扰素β1b的含量

目的建立测定注射用重组人干扰素β1b(recombinant human interferonβ1b,rh IFNβ1b)成品中干扰素β1b(interferonβ1b,IFNβ1b)含量的反相高效液相色谱法(reversed phase high performance liquid chromatography,RPHPLC)。方法采用色谱柱ZORBAX 300SB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm),以含95%水、5%乙腈、0.1%三氟乙酸的混合液为流动相A液,以含5%水、95%乙腈、0.1%三氟乙酸的混合液为流动相B液,流速为1.5 ml/min,梯度洗脱10 min(A液从70%~30%),检测波长为214 nm,柱温为35℃,进样量为20μl。对该方法的适用性、线性、精密度、重复性和准确度进行验证。用建立的方法检测3批注射用rh IFNβ1b成品中IFNβ1b的含量。结果建立的方法系统适应性良好;IFNβ1b在20~100μg范围内,与峰面积呈良好的线性关系,r2=0.998;供试品溶液连续6次进样,峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.97%;6份同一批供试品IFNβ1b含量的平均值为302.83μg/ml,RSD为0.99%;40、60和80μg/ml的IFNβ1b加标平均回收率分别为93.1%、94.18%和93.67%,RSD均2%。3批注射用rh IFNβ1b成品中IFNβ1b的含量分别为389.8、364.5和304.6μg/ml。结论建立的RP-HPLC法操作简便,精密度、重复性、准确度好,可用于测定注射用rh IFNβ1b成品中IFNβ1b的含量。     

气相色谱法检测重组人血白蛋白中异丙醇残留量

目的建立重组人血白蛋白产品中异丙醇残留量检测的气相色谱法。方法色谱条件:DB-624毛细管色谱柱(30 m×0.53 mm,3μm);进样口温度150℃;检测器为FID,温度200℃;空气流量400 ml/min;氢气流量40 ml/min;载气为高纯氮气,流量6.0 ml/min;程序升温:起始温度60℃保留5 min,以40℃/min升至120℃,保持3 min;分流进样,分流比为5∶1;进样量为1μl。以正丁醇为内标,对建立的方法进行专属性、精密度、准确度、耐用性验证,确定该方法的线性范围和检测限。用建立的方法检测3批重组人血白蛋白样品中异丙醇残留量。结果异丙醇浓度在10~300μg/ml范围内,与异丙醇与正丁醇峰面积比的线性关系良好(r=0.999 9),最低检出限为0.09μg/ml;该检测条件下与异丙醇性质相似的甲醇和乙醇对异丙醇的测定基本无影响;异丙醇与正丁醇峰面积比3次检测结果的RSD为0.4%,精密度良好;不同浓度异丙醇分别与重组人血白蛋白等体积混合,3次检测结果的回收率在94.2%~105.0%之间,准确度良好;不同检测器温度和不同进样口温度条件下测定的色谱峰面积的平均RSD分别为1.6%和2.2%,对测定结果基本无影响。3批重组人血白蛋白样品均未检测出异丙醇残留,符合《中国药典》三部(2015版)推荐标准。结论建立的气相色谱法快速、准确,可用于检测重组人血白蛋白中异丙醇的残留量。     

康柏西普制品中CHO细胞DNA残留量的检测

目的建立特异的CHO细胞DNA残留量荧光定量PCR(Q-PCR)检测方法。方法采用DNeasy Tissue Kit提取CHO细胞基因组DNA,制备DNA标准品;确定Q-PCR反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立CHO细胞DNA残留量Q-PCR检测方法,并验证其专属性、准确性及精密性;用建立的方法对1003b02、1008b05、1012b09、1104b04、1108b13、1112b24批康柏西普原液的CHO细胞DNA残留量进行检测。结果建立的标准曲线Ct值与模板DNA浓度的对数值之间呈良好的线性关系,相关系数为0.99以上;检测HUVEC、HEK293细胞的DNA残留量均无特异性扩增曲线;检测高、中、低浓度的DNA标准品(105、103、101pg/ml)的平均回收率均在Q-PCR方法可接受的回收率范围(50%²00%)内,批间变异系数分别为9.3%、21.8%、26.8%;检测100pg/ml浓度的DNA标准品的平均回收率为111.6%,变异系数为20.4%;康柏西普原液的DNA残留量远低于100 pg/剂量。结论已成功建立特异的CHO细胞DNA残留量Q-PCR检测方法,该方法专属性好,准确性及精密性高,可作为CHO宿主细胞DNA残留量的常规检测方法。     

滴定痘苗病毒的噬斑血吸附法的优化

目的对滴定痘苗病毒的噬斑血吸附法进行优化,克服该方法稳定性差、结果数据偏差大的问题。方法通过预试验确定痘苗病毒的最佳稀释倍数、病毒吸附温度及鸡血球加入方法等参数。采用优化的噬斑血吸附法,对天坛株痘苗病毒的原始种子批、主种子批、工作种子批和参考苗进行滴定,计算变异系数(CV),确定试验内、试验间和不同实验人员间的精密度。利用Qstat软件分析本次与以往滴定结果之间的关系。结果病毒的最佳稀释度为10-6,最佳吸附温度为25～30℃,加入鸡血球的最佳方法为病毒吸附72h后,弃去部分培养液,再加入鸡血球。4种样品测定结果的试验内、试验间和不同实验人员间的变异系数均小于5%,病毒滴度分别为(7.12±0.18)LgPFU/ml、(7.79±0.21)LgPFU/ml、(7.88±0.17)LgPFU/ml和(7.64±0.14)LgPFU/ml,均高于以往滴定结果。本次与以往滴定结果之间存在线性相关性。结论优化了滴定痘苗病毒滴度的噬斑血吸附法,确定了天坛株痘苗病毒的原始种子批、主种子批、工作种子批和参考苗的滴度,为天花疫苗多项检定试验提供了可靠依据。     

甲型肝炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及在贝类检测中的应用

目的建立甲型肝炎病毒(hepatitis A,HAV)荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测方法,用于贝类中HAV的检测。方法选择HAV高度保守的5’UTR区设计引物及探针,以HAV质粒为标准品,HAV活病毒为样本,建立HAV qRT-PCR检测方法;验证该方法的特异性、灵敏度、重复性、准确性及中间精密度;采用建立的方法检测HAV活病毒和贝类样本,并与我国贝类HAV检测国标方法(GB/T22287-2008法)进行比较。结果通过14对引物探针分别对HAV质粒(101~108拷贝/μL)检测结果的比较,选择灵敏度最优的Pan1引物,建立了HAV qRT-PCR检测方法(PAN法)。PAN法对CVA16、CVB3、EVA71、PV等11种RNA病毒均无阳性扩增;灵敏度达10 TCID50/mL;检测2.699~5.699 LgTCID50/mL各浓度HAV活病毒的回收率为82.9%~127.0%,单人和双人检测的变异系数分别为3.0%~7.0%和2.6%~8.4%。PAN法检测HAV活病毒的灵敏度(10 TCID50/mL)优于GB/T22287-2008法;两种方法对20份贝类样本的检测结果均为阴性,符合率为100%。结论建立的PAN法具有良好的特异性、灵敏度、准确性、重复性和中间精密度,可用于贝类样本中HAV的核酸定量快速检测。     

气相色谱法测定甲型肝炎灭活疫苗中三氯甲烷残留量

目的应用顶空气相色谱法测定甲型肝炎灭活疫苗中三氯甲烷残留量。方法采用毛细管色谱柱DB-WAX(30m×0.53mm×0.50μm),ECD检测器,以氮气为载气,顶空进样。以不同基质稀释的三氯甲烷工作液绘制标准曲线,并对方法进行适用性及专属性、线性关系、精密度、定量限、检出限和准确性验证。结果通过绘制的2条标准曲线可见,存在基质效应的影响。甲肝疫苗中三氯甲烷与其他杂质峰的分离度为2.58;三氯甲烷在20～100ng/ml的浓度范围内线性关系良好(R2=0.9993);精密性良好,检测结果的RSD均小于5%;最低检出限为1.2ng/ml,最低定量限为4.8ng/ml;检测高、中、低3种浓度样品的加标回收率分别为(95.6±1.8)%、(95.5±3.1)%和(101.9±2.1)%。结论顶空气相色谱法简便灵敏,结果准确可靠,适用于甲型肝炎灭活疫苗中三氯甲烷残留量的测定。     

检测重组人血小板生成素含量的改良双抗体夹心ELISA方法的建立

目的建立检测重组人血小板生成素(rhTPO)含量的改良双抗体夹心ELISA方法。方法用棋盘滴定法确定包被单抗、一抗和酶标二抗的最佳工作浓度;绘制标准曲线,确定线性范围、检测限和定量限;检测该方法的准确性(回收率)、精密性和特异性,并与Lowry法检测结果进行比较。结果包被单抗的最佳包被浓度为1.0μg/ml,一抗和酶标二抗的最佳使用浓度分别为1∶5000和1∶10000;检测的线性范围为(125～4000)pg/ml,检测限为75pg/ml,定量限为189pg/ml;不同浓度rhTPO的回收率在(97.0±2.1)%～(105.0±8.5)%之间;6批样品的试验内变异系数在3.2%～8.1%之间,试验间变异系数在5.7%～10.4%之间,特异性良好;与Lowry法检测结果具有良好的相关性。结论已建立检测rhTPO含量的改良双抗体夹心ELISA法,准确性、精密性、特异性良好,可用于rhTPO研究及生产过程中的定量分析。     

微波消解—电感耦合等离子体发射光谱法测定林蛙油中的常量和微量元素

用微波消解-电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)测定了林蛙油中的常量元素和微量元素,优化了微波消解和ICP-AES处理条件,本法的检测下限为0.050~2.10μg·g-1,相对标准偏差在0.05%~4.85%之间,加标回收率在93.9%~104.1%之间,通过分析国家标准物质GBW10050(大虾)和GBW10018(鸡肉)来验证方法的准确度和精密度,测定值和标准值吻合,表明此方法具有操作简便,检出限低,线性范围宽,精密度高,准确度好等优点,能同时满足常量元素和微量元素的检测要求。     

两种检测人凝血因子Ⅸ中肝素含量方法的验证及比较

目的验证人凝血因子Ⅸ中肝素含量的两种测定方法(凝固法及全自动血凝仪测定法),并进行比较。方法分别验证凝固法的准确度、精密性及全自动血凝仪测定法的线性、准确度、精密性。结果凝固法检测3批次原液的6次加标试验回收率为92%~100%,3批成品连续6次测定结果的CV为11%~16%;全自动血凝仪测定法在肝素浓度0~0. 5 IU/mL范围内,与凝集时间的对数呈良好的线性关系,r均> 0. 99,检测3批原液6次加标试验的回收率为98%~101%,3批成品连续6次测定结果 CV为2%~3%。结论两种方法均具有良好的准确度及精密性,均可用于人凝血因子Ⅸ中肝素含量的测定,全自动血凝仪测定法更快速、准确。     

ICP-AES法测定进口废塑料金属涂层中金属元素的含量

采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES),建立了对进口废塑料金属涂层中4种金属元素含量同时进行测定的检测方案。结果表明:标准曲线相关系数均大于0.999,检出限为0.003～0.030μg/ml,样品平均加标回收率在94.8%～104.5%之间,相对标准偏差在1.0%～4.7%之间。该方法操作简单,具有良好的准确度和精密度,能够满足废塑料金属涂层中金属含量检测的要求。     

巨细胞病毒IgG定量ELISA检测方法的建立及初步应用

目的建立巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)IgG定量ELISA检测方法,并进行初步应用。方法用CMV IgG(50 U/ml)标准品建立CMV IgG ELISA定量检测方法,确定该方法的最佳线性范围;制备室内质控血清并进行标定。对该方法进行重复性、中间精密性、准确性、特异性验证,并与Dia.Pro CMV IgG ELISA试剂盒进行比较。用建立的ELISA法检测689人份健康献浆员血浆的CMV IgG抗体效价。结果建立的CMV IgG定量ELISA检测方法的最佳线性范围为0.000 78～0.05 U/ml;制备的室内质控血清的抗体效价为(5.67±0.55)U/ml;重复性试验检测结果的变异系数为4.6%～9.8%,中间精密性试验检测结果的变异系数为9.7%～10.6%;该方法检测3个浓度标准品的回收率为107.01%～112.97%;样品稀释液和血清中的其他一些干扰因素对检测结果影响较小;该方法与Dia.Pro CMV IgG ELISA试剂盒检测血浆样品的相关系数r=0.81。该方法检测689人份健康献浆员血浆样品的CMV IgG抗体效价≥10 U/ml的占30.8%。结论建立的CMV IgG定量ELISA检测方法操作简便,精密性良好,特异性强,可用于人血浆中CMV IgG的定量检测。