重组戊型肝炎疫苗抗原P179表征分析

目的对重组戊型肝炎疫苗(recombinant hepatitis E virus,rHEV)抗原P179表征进行分析。方法取3批HPLC及电泳纯度均为100%的rHEV抗原P179原液,采用SDS-PAGE法检测相对分子质量及二聚体含量;OPA-FMOC全自动柱前衍生-Amino Quant氨基酸分析法测定氨基酸组分;电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(electrospray ionizationquadrupole time-of-flight-mass spectrometry,ESI-Q-TOF2-MS)法分析C-末端、Edman降解法测定N-末端氨基酸序列;HPLC法进行肽图分析;毛细管等电聚焦电泳法测定等电点;圆二色光谱仪分析其二级结构;透射电镜负染法观察蛋白颗粒状态;双抗体夹心ELISA法检测抗原活性。结果 3批rHEV抗原P179相对分子质量在17 500~21 300之间;二聚体占总蛋白的85%以上;氨基酸组分、C-末端氨基酸序列、N-末端氨基酸序列、肽图、等电点等均与预期相符;3批rHEV抗原P179二级结构中,α螺旋4.8%~5.6%,β折叠34.8%~36.4%,β转角20.8%~22.2%及无规卷曲37.7%~38.0%;透射电镜观察可见大小均一,粒径约20 nm的蛋白颗粒;抗原活性比值在5.0×105~2.0×10~6CCU/mg范围内。结论 3批r HEV抗原P179结构特征均一,与设计相符,为该疫苗的产业化奠定了基础。     

重组戊型肝炎疫苗原液长期稳定性评价

目的评价重组戊型肝炎疫苗原液的长期稳定性。方法将连续3批重组戊型肝炎疫苗原液置(-20±2)℃保存12个月,分别于第0、3、6、9和12月取样,依据《中国药典》第三部和第四部(2015版)和《重组戊型肝炎疫苗制造及检定规程(暂定)》规定进行无菌检查、蛋白含量、纯度、相对分子质量、等电点和细菌内毒素检测及紫外光谱扫描;第6和12月,分别将3批原液配制成疫苗进行效力测定。结果 3批疫苗原液在各时间点无菌检查均为阴性,细菌内毒素含量均小于5 EU/ml,蛋白含量在3.47~3.81 mg/ml,单体及二聚体总量在96.0%以上,二聚体占总蛋白的85%~100%,单体相对分子质量为19 500~19 700,等电点检查主区带在4.05~5.80之间,紫外光谱扫描最大吸收峰在(278±3)nm,3批原液第6和12月的效力ED_(50)值≤1.0μg,均符合暂定制检规程。结论重组戊型肝炎疫苗原液在(-20±2)℃可稳定存放12个月,本研究为原液的存放效期提供了可靠的数据支持。     

重组戊型肝炎疫苗的无菌生产工艺验证

采用胰酪胨大豆肉汤培养基进行模拟灌装,对灌装后的注射器进行培养,根据注射器内培养基的污染情况,评估现行重组戊型肝炎疫苗无菌生产工艺的有效性。结果表明:灌装后的注射器经培养均未出现培养基污染,现行重组戊型肝炎疫苗的无菌生产工艺可确保产品的无菌性。     

重组戊型肝炎疫苗P179抗原蛋白颗粒及二聚体的稳定性分析

目的分析重组戊型肝炎疫苗P179抗原蛋白颗粒及二聚体在不同条件下的稳定性,为该抗原的纯化工艺及原液储存条件提供参考。方法将重组戊型肝炎疫苗原液置不同温度、不同p H、高盐浓度、高盐低p H条件下及低温长期储存后,通过透射电镜观察P179抗原蛋白颗粒状态,SDS-PAGE分析二聚体含量。结果 HEV抗原在不同温度、不同p H、高盐浓度、高盐低p H条件下,及低温储存不同时间,P179抗原蛋白颗粒维持在20 nm左右,二聚体含量不低于80%;P179抗原低温储存24个月,其蛋白颗粒及二聚体含量均未发生明显改变。结论重组戊型肝炎疫苗P179抗原蛋白颗粒及二聚体稳定性较好。     

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。     

重组戊型肝炎疫苗的生殖毒性试验

目的探讨重组戊型肝炎疫苗对大鼠的生殖毒性。方法将Wistar雌性大鼠分为4组:低剂量组(每只20μg HEV)、高剂量组(每只40μg HEV)、生理盐水对照组及佐剂对照组,每组30只。雌鼠于交配前给药2次,初次给药后2周进行2次给药,2次给药后1周,进行雌雄鼠合笼交配,于妊娠7和14 d进行3、4次给药。每天观察雌鼠一般临床症状;交配前每周称雌鼠体重1次,交配后每周称体重2次,每周定期测定1次摄食量;于妊娠21 d安乐死孕鼠,分离出胎仔,检测疫苗对雌鼠生殖能力、胎仔发育、胎仔骨化程度、胎仔内脏畸形的影响,取孕鼠和胎仔血液,分离血清,ELISA法检测抗HEV Ig G抗体水平。结果各组大鼠精神状态未见异常,皮毛光亮,灵敏,大小便色正成形,注射局部未见充血、肿胀、溃烂、硬结等;疫苗对孕鼠体重、摄食量均无明显影响(P0.05);各剂量组窝平均着床数、窝平均黄体数、窝平均活胎数、受孕率、活胎率、吸收胎率、死胎率、畸胎率与生理盐水对照组和佐剂对照组相比,差异均无统计学意义(P0.05);各剂量组胎仔身长、尾长、体重、胎盘重和性别比与生理盐水对照组和佐剂对照组相比,差异均无统计学意义(P0.05);各剂量组胎仔上枕骨的骨化程度均在0级和Ⅰ级正常范围以内,胸骨骨化不全率与生理盐水及佐剂对照组相比,差异无统计学意义(P0.05);各组胎仔内脏均未见畸形;孕鼠及胎仔血清中均检测到抗HEV Ig G抗体。结论重组戊型肝炎疫苗对孕鼠及胎仔安全、有效。     

病毒性肝炎相关职业人群戊型肝炎疫苗认知度及接种意愿调查

<正>戊型病毒性肝炎(简称戊肝)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)感染引起的急性病毒性肝炎。我国是戊肝高发地区,国家卫生和计划生育委员会传染病报告系统统计显示,我国戊肝发病人数呈明显上升趋势,2012年首次超过甲型肝炎,成为急性肝炎的第一大病因[1]。戊肝平均住院治疗费用在各类病毒性肝炎中最高(约2万元以上)[2],加重了患者的负担。在科技部、卫计委、教育部等各级领导的关心与支持下,2012年10月27日,全球首支戊肝疫苗在     

重组戊型肝炎疫苗菌种库的建立及其稳定性

目的建立重组戊型肝炎疫苗工程菌三级种子库,并分析其稳定性。方法将工程菌株HEV179/BL21(DE3)复苏活化,经全面检测合格后冻干保存即为原始种子库;原始种子库传代扩增,经全面检定合格后,冻干保存即为主种子库;主种子库经传代扩增和全面检定合格后,甘油冻存即为工作种子库。对三级种子库进行全面检定,并对工程菌进行冻干及甘油冻存稳定性、甘油冻存时间稳定性及质粒稳定性检测。结果建立的三级种子库经全面检定合格;菌种冻干稳定性、甘油冻存稳定性、甘油冻存时间稳定性及质粒稳定性指标均合格,菌种生长特性、遗传和表达稳定性均未发生变化。结论成功建立了HEV179/BL21(DE3)工程菌三级种子库,菌种稳定性良好,适用于重组戊型肝炎疫苗的工业化生产。     

戊型肝炎疫苗评价用小鼠品系的比较

目的比较不同品系及相同品系不同来源BALB/c小鼠对戊型肝炎疫苗(HE疫苗)的免疫应答,探讨适用于HE疫苗评价的小鼠品系,规范疫苗效力评价用动物。方法分别用2家企业制备的HE疫苗免疫BALB/c、C57BL/6、KM和NIH 4种品系小鼠及3种不同公司来源的BALB/c小鼠,均免疫1针,28 d后采血,分离血清,检测抗体应答,计算效力ED_(50)。结果 2家疫苗免疫C57BL/6、KM和NIH小鼠时,各剂量组均表现出敏感应答,提示C57BL/6、KM和NIH小鼠对本研究中的2家疫苗不能灵敏地反映出剂量变化趋势,不适用于HE疫苗效力评价;BALB/c小鼠对2家企业各剂量组HE疫苗均呈现良好的免疫应答,且呈明显的剂量效应关系。3种不同来源的BALB/c小鼠免疫HE疫苗后,抗体应答存在差异。结论 BALB/c小鼠可作为评价HE疫苗免疫原性和效力ED_(50)的模型动物;应用BALB/c小鼠进行疫苗评价时需固定小鼠来源。     

重组HIV-1 DNA疫苗工程菌中试发酵工艺的优化

目的优化重组HIV-1DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法优化质粒转化条件,制备工程菌Jm109/pVAX1-MEGp24种子液,连续传30代,检测其遗传稳定性;优化培养基成分、补料基质、补料方式和培养时间,确定最佳发酵参数;并应用最佳发酵参数,于50L发酵罐进行3批中试规模的发酵,考察在发酵培养过程中质粒的稳定性和超螺旋质粒的比例。结果工程菌在连续传代30次后,质粒拷贝数基本保持稳定;最佳发酵参数为:采用以甘油为碳源的培养基,以梯度恒速流加方式补料,培养时间13h;通过3批稳定发酵,最终可获得湿菌67.0～68.6g/L,质粒含量可达1.62～1.73mg/g菌,超螺旋质粒的比例达93%以上。结论已建立了稳定的重组HIV-1DNA疫苗工程菌中试发酵工艺,为进一步规模化生产奠定了基础。     

表达重组谷氨酸脱羧酶工程菌发酵条件的优化

目的对表达谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,EC4.1.1.15,简称GAD或GDC)的重组大肠杆菌的发酵条件进行优化。方法通过单因素试验优化表达GAD的重组大肠杆菌B3C1的诱导剂IPTG添加时间、IPTG浓度、诱导时间、诱导温度,再经响应面分析法优化工程菌的发酵条件(氯化钠、胰化蛋白胨、酵母粉、摇床转速、初始pH值、培养时间、接种量、装液量)。结果工程菌的最佳诱导条件为:IPTG添加时间为工程菌接种后4 h,IPTG浓度为0.8 mmol/L,诱导时间为4 h,诱导温度为35℃;工程菌的最佳发酵条件为:酵母粉1.01%,氯化钠0.6%,胰化蛋白胨1.5%,培养时间11.25 h,摇床转速250 r/min,初始pH值6.5,接种量3.0%,装液量11.70 ml。工程菌在该条件下发酵培养,GAD酶活达1 227.33 U,比优化前提高了12.29%。结论已成功对表达GAD的重组大肠杆菌的发酵条件进行了优化,为其工业化生产奠定了基础。     

毕赤酵母表达的含前S抗原重组乙型肝炎疫苗的稳定性

目的考察毕赤酵母表达的含前S抗原重组乙型肝炎疫苗原液和成品的稳定性。方法将3批疫苗原液置4℃存放,分别于0、1、2、3、6个月时取样,测定其在各时间点的乙型肝炎表面抗原S、前S1(PreS1)、前S2(PreS2)抗原滴度及HPLC纯度;将3批疫苗成品置25℃和4℃存放,进行加速稳定性和长期稳定性试验,分别于0、1、2、3、6个月和0、3、6、9、12、18、24个月时取样,进行小鼠效力、pH值、细菌内毒素和无菌测定。结果 3批疫苗原液于4℃保存6个月,表面抗原S、PreS1、PreS2抗原滴度及HPLC纯度均无明显变化;3批疫苗成品于25℃放置6个月和4℃放置24个月,各个时间点的小鼠效力均符合暂定规程的要求,pH值保持稳定,细菌内毒素和无菌试验均符合《中国药典》三部(2005和2010版)要求。结论毕赤酵母表达的含前S抗原重组乙型肝炎疫苗原液及成品稳定性良好。     

重组质粒DNA D-GPEi工程菌发酵工艺的优化

目的优化重组质粒D-GPEi工程菌发酵工艺条件。方法控制相关发酵参数,观察溶解氧浓度、比生长速率和培养时间对工程菌生长和质粒浓度的影响。结果发酵培养对数生长期溶解氧浓度控制在30%~50%。补料前比生长速率为0.5~0.7/h,6 h开始补料,比生长速率下降,12 h后比生长速率为0.1~0.2/h。连续发酵3批工程菌,21 h后收集菌体,得到菌体平均产量为89.4 g/L(A=52.6),质粒平均产量为359.8 mg/L。3批工程菌浓度和质粒拷贝数差异无显著意义。结论此发酵工艺得到工程菌浓度和质粒拷贝数较高,重复性好,适用于大规模工业化生产。     

Mg~(2+)和氨基酸对重组大肠杆菌BL21(DE3)生长及羧肽酶原B表达的影响

目的研究Mg2+和氨基酸对重组菌株生长及表达pCPB的影响。方法通过摇瓶和发酵罐培养,观察不同Mg2+浓度和氨基酸对重组菌的生长和羧肽酶原B表达的影响。结果添加1g/L Mg2+能提高质粒的稳定性;添加氨基酸能使羧肽酶原B表达量由18·7g/L提高到24g/L。结论添加适量的Mg2+和氨基酸能促进重组菌的生长和提高目的蛋白的表达量。     

重组免疫毒素IL-6_(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中自诱导表达条件的优化

目的优化重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,以提高菌体浓度及可溶性目的蛋白的表达量。方法采用摇瓶培养,利用单因素和正交试验对工程菌自诱导的培养条件(接种量、诱导时间、诱导温度、装瓶量)和培养基组分(有机氮源、无机氮源、碳源、有机酸)进行优化,检测菌体浓度、可溶性目的蛋白的表达量及质粒稳定性。结果确定最适自诱导培养条件为装瓶量20 ml/250 ml、接种量2%,28℃诱导25 h;最适自诱导培养基组分为:蛋白胨2%、酵母浸粉0.5%、Na2HPO425 mmol/L、KH2PO425 mmol/L、硫酸铵25 mmol/L、葡萄糖0.05%、甘露醇1%、乳糖0.6%、苹果酸钠20 mmol/L、MgSO40.5 mmol/L。此时可溶性目的蛋白的表达量和菌体浓度分别为LB培养基(IPTG诱导)的1.76和2.12倍,质粒稳定性由87%提高至98%。结论优化了重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,为其工业化生产奠定了基础,也为自诱导在其他重组蛋白药物生产中的应用提供了参考。     

治疗性双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺研究

目的研究双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法首先通过计算质粒拷贝数,检测工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在传代过程中的遗传稳定性,通过摇瓶培养确定培养基组成,再在30L发酵罐内,通过改变培养基成分、培养时间、补料方式,确定最佳发酵参数。并将确定的最佳发酵参数应用于50L发酵罐连续3批中试规模的发酵,同时考察在发酵培养过程中质粒稳定性和超螺旋质粒DNA的比例。结果工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在连续传代30次后,质粒拷贝数保持稳定。确定最佳发酵参数为以甘油为碳源的培养基培养,梯度恒速流加方式补料,培养时间为10h。通过3批稳定发酵,最终可获得湿菌58.0~71.8g/L,质粒含量可达到1.11~1.58mg/g菌,超螺旋质粒DNA的比例达93%以上。结论已建立了稳定的双质粒HBV DNA疫苗工程菌中试发酵工艺,为进一步规模化生产奠定了基础。     

Optimization of conditions for single-step purification of recombinant hepatitis B surface antigen produced in Pichia pastoris using ion exchange chromatography

ABSTRACT

The adsorption and release of rHBsAg extracted from the final dosage form on various ion exchange resins and under different pH conditions were investigated after its peptide map and isoelectric point (PI) determination. Efficient antigen adsorption to the anion exchange resins occurred when the pH value of the protein buffer was adjusted to 5.0. In purification of rHBsAg derived from the yeast crude extract using Q Sepharose FF column, with adjusting the pH value of the crude extract to 5.0 (i.e., near to the target protein PI) and using 2M NaCl, rHBsAg with high purity (up to >95%) was obtained.

Abbreviations: rHBsAg, recombinant hepatitis B surface antigen; Alhydrogel, aluminum hydroxide; IEF, isoelectric focusing; PI, isoelectric point; SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; RP-HPLC, reversed-phase high-performance liquid chromatography; SE-HPLC, size-exclusion high-performance liquid chromatography; PBS, phosphate-buffered saline     

人白细胞介素-6成熟肽基因重组及其在大肠杆菌中的表达

将PCR扩增的人白细胞介素-6（hIL-6）成熟肽基因与PJLA502表达载体重组，在大肠杆菌中高效表达出rhIL－6。经SDS－PAGE分析，rhIL－6表达量占菌体可溶性蛋白的40％以上。经免疫印迹证实，rhIL－6具有良好的抗原特异性。复性后，用MTT法测定IL－6依赖株7TD1细胞增殖活性，rhIL－6比活性达2．5×10~6u／mg蛋白。