固化床反应器大规模灌注培养CHO-C28细胞生产乙型肝炎病毒表面抗原

目的开发一种应用固定化反应器大规模培养CHO-C28细胞的灌注培养工艺,用于制备重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。方法利用自行研发的微型反应器以轴向旋转模拟固化床内培养基流经载体表面,分析固化床反应器灌注培养CHO-C28细胞表达HBsAg的可行性;使用AP20小型固化床反应器进行小试工艺;将AP20反应器消化后收集的2.3×1010个细胞接种至AP200固化床反应器,对灌注工艺进行中试放大,收获培养液,测定溶氧、pH、葡萄糖、乳酸及HBsAg蛋白浓度,并与转瓶培养工艺进行比较。结果预装无纺纸片的微型反应器接种CHO-C28细胞后,可连续灌注培养60 d,HBsAg表达水平为1 100 ng/ml。AP20反应器接种CHO-C28细胞后,HBsAg表达水平在维持期约1 100 ng/ml;将AP20反应器培养至第10天的CHO-C28细胞消化后,收集2.3×1010个细胞,接种AP200反应器,可连续灌注培养60 d,生长期中,葡萄糖消耗速率最高可达450 g/d,维持期葡萄糖消耗速率降至250 g/d,整个维持期内葡萄糖浓度维持在约1.5 g/L,收液中乳酸积累量为22 mmol/L,HBsAg表达水平约1 200 ng/ml。固化床灌注培养工艺的工艺条件控制精度高,培养环境更适合CHO-C28细胞生长,培养周期与转瓶工艺相当。结论固化床反应器灌注培养CHO-C28细胞工艺与转瓶工艺HBsAg表达水平相当,具备较高的产业化应用价值。     

表达乙型肝炎表面抗原的重组CHO细胞无血清培养基的优化及生物反应器培养

目的优化表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的重组CHO细胞的无血清培养基,并进行生物反应器高密度培养。方法通过对现有重组CHO细胞无血清培养基SFMB的氨基酸、蛋白类激素、蛋白水解物等的优化,建立针对表达HBsAg的重组CHO细胞无血清低蛋白(<10mg/L)培养基SFMC。并利用此培养基在生物反应器中分批、流加、灌注悬浮培养重组CHO细胞,通过最大细胞密度和HBsAg产率评价不同的培养模式。结果 SFMC与原培养基SFMB相比,使重组CHO细胞的最大细胞密度提高了20%,HBsAg表达量提高了25%。在生物反应器培养过程中,灌注培养的重组CHO细胞表达的HBsAg产率为0.70mg/(L·d),较分批和流加培养的0.30mg/(L·d)提高了约133%。结论通过无血清培养基优化及生物反应器高密度培养,可显著提高重组CHO细胞表达HBsAg的效率。     

生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a的CHO细胞工艺的建立

目的建立生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a(IFNβ1a)的CHO细胞的工艺,探讨CHO细胞表达分泌IFNβ1a的反应动力学规律。方法应用15 L生物反应器悬浮微载体方式培养CHO工程细胞,比较不同时期细胞的生长形态、数量、生物活性、灌流量、葡萄糖消耗量及其他物理参数的变化规律。结果 15 L生物反应器中在初始pH 6.86～7.20,溶氧30%～70%,温度36.8～37.2℃,微载体4 g/L,罐流量6.5 L/h的条件下连续培养40 d,CHO工程细胞的密度维持在5×105个/ml之间,收获的细胞液中重组人IFNβ1a的生物活性为2.5×104～4.0×105IU/ml,葡萄糖消耗量在0.5～2.5 mg/ml之间。结论初步建立了15 L生物反应器培养分泌重组人IFNβ1a的CHO细胞的工艺,为进一步建立工业化生产工艺奠定了基础。     

人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白重组CHO细胞生产工艺及质控方法的建立

目的 利用国产无血清培养基T22,建立人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)重组CHO细胞大规模生产工艺及质控方法。方法用500 L生物反应器培养重组CHO细胞,通过深层过滤、亲和层析、离子交换层析、疏水层析等方法纯化表达上清中的目的 蛋白,超滤浓缩制成原液,并按照《中国药典》三部(2010版)及现有的质控方法和标准建立相应的质控方法。结果重组CHO细胞在500 L生物反应器中培养15 d左右,细胞密度最高可达8.6×106个/ml,收获时细胞活力为70%左右,rhTNFR:Fc蛋白表达量可达3.3 g/L;纯化的目的 蛋白纯度可达98%以上,总收率超过30%;各项质量指标均符合新药申报标准。结论建立的rhTNFR:Fc重组CHO细胞生产工艺及质控方法稳定可靠,使用国产培养基大大降低了生产成本。     

生物反应器细胞培养制备人用狂犬病疫苗

目的应用生物反应器培养细胞和病毒,大规模生产人用狂犬病疫苗。方法以巴斯德PV2061为毒种,以143代以内Vero细胞为培养基质,应用生物反应器,每升投放25g微载体,灌流式细胞培养,连续收获病毒液,经浓缩、灭活、纯化,制成Vero细胞狂犬病疫苗。结果细胞培养密度达1.2×107～1.5×107个/ml,病毒感染后可连续收获18～22d,病毒最高滴度8.5LogLD50/ml,平均滴度7.6LogLD50/ml。经柱层析纯化,杂蛋白去除率达99.95%以上,总蛋白含量≤80μg/g,DNA含量≤10pg/0.5ml,GP含量3.5～4.5IU/0.5ml,效力≥4.5IU/0.5ml。结论应用生物反应器细胞培养,可以大规模生产优质Vero细胞人用狂犬病疫苗。     

表达长效生长激素的CHO细胞培养工艺的优化及放大

目的 在NewBrunSwick310 14 L生物反应器中培养表达重组人长效生长激素(recombinant human growth hor-mone Fc fusion protein,rhGH-Fc)的CHO细胞,优化工艺参数以提高表达量,并进行NewBrunSwick310 14 L到New-BrunSwic...     

WAVE生物反应器在生物制品生产中的应用

WAVE生物反应器是一种新型的摇床式生物反应器,是新近发展起来的一种细胞培养的技术平台。其通过摇动板带动细胞袋内的培养基产生波浪,促进营养物质的交换和氧气的传递;细胞袋一次性使用,无需清洗和验证;具有悬浮培养和贴壁培养的功能,现已广泛应用于培养HEK293细胞、昆虫细胞、CHO细胞、杂交瘤细胞、NSO细胞、果蝇细胞、BHK细胞、植物细胞、杀伤性T细胞、MDCK细胞、EFL细胞、酵母菌等以及重组蛋白和单克隆抗体的生产。本文就WAVE生物反应器的组成、特点及其在生物制品生产中的应用作一综述。     

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)免疫效果的观察

目的进一步观察重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的免疫效果。方法选择江苏省响水县某中心小学学生及教师,经筛查HBsAg、antiHBs和antiHBc均为阴性的98名作为观察对象,使用10μg重组乙肝疫苗(CHO细胞),按0、1、6个月3针免疫程序进行免疫效果观察。结果全程免疫后1个月,85名学生中,抗HBs阳性83名,阳转率为97.65%,GMT为172.50mIU/ml,最高可达498.12mIU/ml。男性、女性的抗HBs阳转率分别为97.50%和97.78%,GMT分别为170.11和148.42mIU/ml。结论10μg重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)应用于小学生,免疫效果良好。     

30L生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂

目的应用30L填充床生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA)。方法将表达rht-PA的CHO细胞株用含10%胎牛血清的IMDM复苏并放大培养,接种至30L生物反应器中,并采用BiocommandPlus软件系统实时监控。先用含血清的培养基生长培养,再更换为无血清培养基进行表达培养。在整个培养过程中,采用灌流培养方式,每日采样测定培养上清中葡萄糖浓度,隔日测定rht-PA的表达水平及生物学活性。采用Lysine-Sepharose4B和Zn2+-Sepharose4B两步亲和层析法纯化rht-PA,并检测纯化产物的比活、产率及纯度。结果整个培养过程持续51d,包括生长培养6d,表达培养45d,平均日灌流量为46.7L,最高达60L,共收获表达培养液约2100L;rht-PA的平均表达水平为15.15mg/L,最高可达19.25mg/L,生物学活性平均约为8000IU/ml;表达培养至第13天时,葡萄糖消耗量达最高水平(15.97g/L·d);纯化的rht-PA比活达6×105IU/mg,产率为63%,纯度达99%以上。结论应用30L填充床生物反应器可实现重组CHO细胞的长时间连续培养及产物rht-PA的高效表达。     

不同种类与剂量乙型肝炎疫苗在青年中的免疫效果及安全性

目的探讨不同种类与剂量乙型肝炎疫苗在青年中的免疫效果及安全性。方法在江西省上饶市卫生学校抽取乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阴性、健康状况良好的15²0岁学生910名,随机分为A、B、C 3组,按照0、1、6月免疫程序,分别经上臂外侧三角肌全程接种3针10μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)、20μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)和10μg/ml重组乙型肝炎疫苗(酵母),全程免疫后1个月采集接种者静脉血,分离血清,采用放射免疫法检测抗-HBs水平,并进行安全性观察。结果全程免疫后1个月,A组与C组抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和分布相近,差异均无统计学意义(P>0.05);B组的抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和≥500 mIU/ml的分布均明显高于A组和C组(P均<0.01),抗-HBs GMC﹤10和1020岁学生910名,随机分为A、B、C 3组,按照0、1、6月免疫程序,分别经上臂外侧三角肌全程接种3针10μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)、20μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)和10μg/ml重组乙型肝炎疫苗(酵母),全程免疫后1个月采集接种者静脉血,分离血清,采用放射免疫法检测抗-HBs水平,并进行安全性观察。结果全程免疫后1个月,A组与C组抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和分布相近,差异均无统计学意义(P>0.05);B组的抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和≥500 mIU/ml的分布均明显高于A组和C组(P均<0.01),抗-HBs GMC﹤10和10⁴99 mIU/ml的分布显著低于A组和C组(P<0.01或<0.001)。有1名接种者在接种后0.5 h有局部疼痛症状,第2天疼痛消失,未见其他局部及全身不良反应。结论接种高剂量乙肝疫苗的抗-HBs阳转率和抗-HBs GMC水平均高于低剂量乙肝疫苗,提示青年应接种高剂量乙肝疫苗,以建立有效的防御乙肝的免疫屏障。     

抗人A血型杂交瘤细胞高密度培养条件的研究

抗人 A 血型杂交瘤15B_4细胞在 CelliGen 细胞培养罐中进行连续灌注培养,细胞密度达1.6×10~7/ml。每天灌注新培养液量由1000ml 增到2300ml,第14天后又逐日减少至1000ml,死细胞数随着转速的增加和灌注量的减少而增多。血凝效价呈梯度上升,滴度达到2~(14),相当于腹水效价。培养6天 IgM 产量为0.2克/升/天,10～18天波动在1.45～1.8克/升/天。15B_4细胞代谢与葡萄糖、乳酸有关,与氨无关。CelliGen 自控效果较好,适用于杂交瘤细胞的高密度培养。搅拌速度在120～150r/min 对细胞产生的剪切力有明显地破坏作用。溶氧控制系统有待改进。     

高效表达乙型肝炎表面抗原的CHO工程细胞株的构建

目的构建高效表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的CHO工程细胞株。方法从pCIneo质粒出发,构建含有改造了稀有密码子的HBsAgS基因和启动子弱化的二氢叶酸还原酶(DHFR)转录单位的新型表达载体,利用脂质体转染CHO/dhfr-细胞,经3轮氨甲喋呤(MTX)梯度加压筛选和单克隆筛选,获得高效表达HBsAg的CHO工程细胞株,并对HBsAg的分泌动态进行检测。结果所构建的新型表达载体pCI-DS经PCR及酶切鉴定,证明构建正确,转染CHO/dhfr-细胞后,经筛选得到高效表达HBsAg的CHO工程细胞株3F9,表达量达9.21μg/106个细胞·48h。单层细胞培养动态表明,3F9株细胞能在40d内稳定高效表达HBsAg。结论已成功构建稳定高效表达HBsAg的CHO工程细胞株,为提高HBsAg的产量创造了条件。     

生物反应器培养Vero细胞生产肠道病毒71型

目的研究利用微载体技术规模化制备肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的方法。方法利用NBSCelliGen 310 5 L生物反应器进行Vero细胞微载体培养,考察了不同微载体Cytodex-1浓度(3、10、15、20 g/L)对Vero细胞生长代谢及细胞密度的影响,并且与细胞工厂(Cell factory,CF)中Vero细胞染毒后的病毒繁殖进行比较。分别采用上清液、洗涤液、洗脱液模式收毒,比较不同收毒方式中EV71的抗原含量及病毒滴度(CCID50)。结果采用10 g/L微载体浓度,批次培养方式培养Vero细胞120 h后,细胞密度可达5.47×106个/ml;当微载体浓度大于15 g/L时,由于葡萄糖消耗速度快,需采用灌注模式培养。按MOI 0.2染毒后,微载体培养的收毒时间比CF慢48 h,但其病毒滴度可达8.8 Log10CCID50/ml,约为CF的5倍。EV71与微载体存在离子交换吸附作用,按上清液加洗脱液方式收毒,抗原总量可达12 61 U/ml,约为CF的3倍。结论已成功建立了生物反应器微载体5 L发酵培养Vero细胞生产EV71的方法,为进一步EV71大规模培养以及疫苗研发奠定了基础。     

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品的研制

目的制备重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品,用于重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力评价。方法选取检定合格的重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)原液,经协作标定表面抗原蛋白含量后,加入氢氧化铝佐剂和冻干保护剂,冷冻干燥制备重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品,并按《中国药典》三部(2010版)要求进行各项检定。经10次独立试验测定冻干参考品小鼠效力,采用Reed-Münch计算ED50值;将冻干参考品置4℃(8周)、37℃(4和8周)后分别检测疫苗效力,分析其稳定性,依据Q10法进行效期推测;并对2个生产企业10批疫苗进行效力测定,分析其适用性。结果制备的冻干参考品各项指标均符合规定,小鼠ED50均值为0.183μg,CV为50.5%;该CHO细胞效力冻干参考品蛋白含量定为20μg/ml,规格为10μg/0.5 ml;冻干保护剂、冻干工艺对乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力影响较小,冻干参考品在37℃放置不同时间,效力变化不明显,表明冻干参考品稳定性较好,有效期约为7年;10批疫苗中,不合格率为10%,表明该参考品可用于乙型肝炎疫苗(CHO细胞)效力质控。结论制备的冻干参考品可作为重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)效力检定的质控参考品。     

重组HBsAg在汉逊酵母中的分泌表达

目的构建重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)分泌型汉逊酵母工程菌株,并进行诱导表达。方法在HBsAg基因前加酿酒酵母α前导肽(MFα)基因序列作为信号肽,将整个序列优化为汉逊酵母优选密码子,采用搭桥PCR方法分别合成后,通过1对引物PCR法融合在一起。将融合基因插入汉逊酵母穿梭质粒pDGXHP2.0的甲醇氧化酶基因(MOX)启动子下游,构建成多拷贝分泌型重组表达载体。将其电转化多型汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主菌ATCC34438(Ura3-),筛选分泌表达HBsAg的汉逊酵母工程菌株,并比较在YPD、BMMY、MM3种培养基中分泌表达HBsAg的水平,ELISA检测培养上清液中HBsAg的表达量,透射电镜观察类病毒颗粒(VLPs)。结果构建了HBsAg汉逊酵母多拷贝表达质粒pDGXHP2.0-2MFα-HBsAg和pDGXHP2.0-4MFα-HBsAg,筛选获得了分泌表达HBsAg的汉逊酵母HP/2MFα-HBsAg和HP/4MFα-HBsAg。经诱导,工程菌株在YPD培养基中分泌表达的HBsAg量高于在BMMY和MM中的表达量;ELISA定量检测表达量最高可达10μg/ml,培养上清液经透射电镜观察,形成了VLPs。结论HBsAg在汉逊酵母中能够分泌表达,并能形成VLPs,但表达量低于胞内表达量。     

肠道病毒71型在Cellspin系统中无血清微载体培养工艺的建立

目的建立肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)在Cellspin系统中无血清微载体培养工艺,为生物反应器培养EV71工艺的建立奠定基础。方法在Cellspin培养系统中对Vero细胞进行微载体培养,考察不同种类培养基MEM、DMEM/F12、VP-SFM、Opti-SFM、Opti-pro、MD505-199及不同微载体浓度3、5、10 g/L对细胞密度的影响。分别以MOI为0.2及2.0接种EV71至Vero细胞,考察病毒接种量对病毒增殖的影响。分别按培养上清、微载体洗脱液模式收毒,比较不同组分中EV71的抗原含量及TCID50。结果采用5 g/L微载体、VP-SFM培养基时,Vero细胞的密度达4.40×106个/ml;按MOI为2.0染毒,72 h后即可收毒,较MOI为0.2的收毒时间早48 h,按MOI为0.2染毒,收获液上清中的抗原含量达193.5 U/ml,病毒滴度达8.43 Log10TCID50/ml;按上清加洗脱液模式收毒,抗原含量可达573 U/ml。结论成功建立了无血清微载体培养Vero细胞生产EV71的方法,为生物反应器培养EV71工艺的建立奠定了基础。