埃可病毒9型分离株MSH-KM812 VP1基因的遗传特征

目的分析2010年昆明市引起手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)的病原埃可病毒9型(Echovirus 9,E9)分离株MSH-KM812 VP1基因的遗传特征。方法分别采用RD细胞和Hep-2细胞对3份HFMD患儿粪便标本进行病毒分离,应用RT-PCR法分2段扩增病毒VP1基因,并进行序列测定。应用NCBI BLAST软件对所测定的节段序列进行比对;Omiga软件对所测定的节段序列的核苷酸及推导的氨基酸序列进行编辑、比对和拼接;应用Mega 5.05软件进行序列分析,并与15个E9参考株的VP1基因序列进行比较,构建基因系统进化树。结果从3份HFMD患儿粪便标本中分离到1株E9,命名为MSH-KM812,其VP1区的核苷酸长度为888 bp。MSH-KM812株与其他15个E9参考株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为78.6%～98.0%和87.5%～99.3%,与中国分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.7%～98.0%和97.0%～99.3%,其中与中国江苏分离株M10MF37 China2010核苷酸和氨基酸序列同源性最高,分别为98.0%和99.3%,而与德国分离株Hill的核苷酸和氨基酸序列同源性最低,分别为78.6%和87.5%。基因进化树分析显示,MSH-KM812分离株与中国江苏分离株M10MF37 China 2010和中国山东分离株05189-SD-CHN-2005-E9属于同一个进化分枝。结论 MSH-KM812分离株为E9,与中国其他分离株同属一个进化分枝。     

一株柯萨奇病毒B2分离株的VP1基因序列特征分析

目的分析一株柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)B2分离株(CVB2)全VP1基因序列特征。方法用RD细胞对10份HFMD疑似患儿的粪便标本进行病毒分离,利用RT-PCR法从分离的病毒中扩增VP1基因,并测序,采用NCBI BLAST、Mega 6.1和Geneious等软件进行序列分析,并构建系统进化树。结果从10份HFMD疑似患儿粪便中分离到一株CVB2,命名为509/YN/CHN/2010,其全长VP1基因的核苷酸长度与其他CVB2一致,均为846 bp。与中国其他分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.0%~95.3%和97.9%~98.9%,而与国外分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.1%~87.8%和97.9%~98.6%。在进化树上与其他中国分离株分属不同的两个分支,而与M10MG17亲缘关系较近。结论 509/YN/CHN/2010分离株为肠道病毒CVB2,为两个中国分支中的一支。     

一株柯萨奇病毒A9分离株的VP1基因遗传特征分析

目的分析引起病毒性脑炎(viral encephalitis,VE)的一株柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)A9分离株(CVA9)的VP1基因遗传特征。方法采用KMB17细胞对VE患儿粪便标本进行病毒分离,利用RT-PCR法从分离的病毒中扩增VP1全基因,并测序,采用Mega 6.1和Geneious 5.6.5等软件分析其序列,并构建系统进化树。结果从5份VE患儿粪便中分离到一株人CVA9,命名为A108/YN/CHN/2009,其全长VP1基因的核苷酸长度与其他CVA9一致,均为906 bp。与中国其他分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.4%~98.2%和96.4%~99.3%,而与国外分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.0%~96.0%和92.7%~99.0%。在进化树上与其他中国分离株属同一分支中不同两个亚分支,与JB141230009亲缘关系较近。结论 A108/YN/CHN/2009分离株为肠道病毒CVA9血清型,与其他中国分离株同属一个基因簇。     

2009年云南省昆明地区柯萨奇病毒B5的遗传特性分析

目的对2009年中国云南省昆明地区柯萨奇病毒B5(Coxsackievirus group B5,CVB5)的部分VP1基因序列进行分析,以了解CVB5的遗传特性。方法收集2009年中国云南省昆明地区临床诊断为无菌性脑炎患儿的200份粪便标本,设计针对CVB的通用引物,利用半巢式RT-PCR扩增部分VP1基因。PCR产物直接测序后,采用Omiga和Mega 5.05等生物学软件进行核苷酸、氨基酸序列及系统进化分析。结果共分离出7株CVB5,其部分VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为92.7%～98.5%和93.6%～100.0%;与中国其他不同地区参考株的核苷酸序列同源性为80.1%～99.1%,其中与中国山东株98388-SD-CHN-1998同源性较低;与中国其他不同地区参考株的氨基酸序列同源性为84.4%～100.0%,其中与中国河南株CoxB5-Henan-2010和中国山东株98388-SD-CHN-1998之间同源性最低;与其他不同国家参考株比较,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在77.5%～89.1%和92.1%～96.3%之间;与原型株Faulkner的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.6%～80.9%和92.1%～95.4%。基因系统进化分析显示,分离的7株CVB5属于相对独立的1个分枝,中国流行株除98388-SD-CHN-1998外,构成1个分枝。结论 2009年中国云南省昆明地区CVB5流行株属于相同基因型。     

一株引起病毒性脑炎的埃可病毒30型分离株的VP1基因序列特征分析

目的分析2009年昆明市病毒性脑炎患儿粪便中分离获得的埃可病毒30型(Echovirus30,Echo30)分离株A363/KM/2009全长VP1基因序列特征。方法从疑似病毒性脑膜炎患儿粪便样本中分离Echo30,提取病毒RNA,采用RT-PCR法扩增病毒VP1基因,并进行测序。采用NCBI BLAST软件对所测定的序列进行数据库比对;采用Geneious软件对Echo30分离株全长VP1基因的核苷酸及氨基酸同源性进行分析;采用Mega 5.1软件对A363/KM/2009分离株进行VP1基因分析,并与20个参考株的VP1序列进行比较。结果分离株为A363/KM/2009,其VP1基因的核苷酸长度与其他Echo30一致,均为867 bp;与其他Echo30分离株核苷酸同源性在76.9%~95.7%之间,氨基酸同源性在88.7%~99.7%之间;与中国株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为84.5%~95.7%和96.9%~99.7%,其中与中国浙江分离株Echo30/zhejiang/10/4的同源性最高,为95.7%;与广西分离株GX10/15的同源性最低,为84.5%。氨基酸序列分析显示,与其他中国株包括脑脊液分离株相比,未见特异的突变位点;与国外分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为76.9%~86.3%和88.7%~97.3%;基因进化树分析显示,与其他中国株分属不同的两个分支,而与Echo30/zhejiang/10/4和Echo30/zhejiang/4/04(CSF)株亲缘关系较近。结论 A363/KM/2009分离株为肠道病毒Echo30,属于中国两个分支中的一支。     

肠道病毒71型甘肃分离株VP1基因特征分析

目的分析肠道病毒71型(Enterovirus,EV71)甘肃分离株VP1基因的特征。方法应用RT-PCR法扩增4株EV71甘肃分离株(46F、47F、51F和55F)的VP1基因,克隆入pTA2载体,进行核苷酸序列测定,并进行序列的同源性比较及进化树分析。结果 4株病毒VP1核苷酸序列长度均为891bp,推导的氨基酸序列含297个氨基酸。51F与55F毒株核苷酸和氨基酸同源性均为100%,46F与47F的同源性分别为99.6%和99.0%,4株病毒与EV71的C4亚型毒株核苷酸同源性在96%以上,氨基酸同源性在99%以上。同源性和进化树分析显示,4株分离株分属2个群,其中51F和55F毒株同属一个群,其与昆明分离株kunming41-08亲缘关系最为相近;46F和47F同属一个群,其与内蒙分离株0723F/NM/CHN/07关系最为相近。结论 4株EV71甘肃分离株属于C4亚型,为中国EV71的基因分型、分子流行病学研究提供了参考。     

一株鼻病毒A22型的分离鉴定及其VP1基因遗传特征分析

目的分析2011年昆明市手足口病患儿粪便中分离获得的人鼻病毒(human rhinovirus,HRV)A22型分离株KM4/2011全长VP1基因的遗传特征。方法采用KMB17细胞对手足口病患儿粪便样本中筛查出的1株HRV样品进行病毒分离,应用RT-PCR法扩增病毒VP1基因,并进行测序,采用BLAST软件对所测定的节段序列进行数据库比对;采用Geneious basic 5.6.5软件进行核苷酸和氨基酸同源性比对;采用Mega 5.05软件将HRV A22及部分HRV A、B和C群全长VP1基因构建系统进化树。结果分离株为KM4/2011,经扩增、测序和序列拼接获得长度为867 bp的VP1基因;KM4/2011株与其他HRV分离株核苷酸和氨基酸的同源性分别为48.1%~91.0%和38.2%~97.6%,其中与HRV A22分离株的核苷酸和氨基酸同源性较高,分别为90.8%~91.0%和97.3%~97.6%;基因进化树分析显示,KM4/2011株与HRV A22基因型属于同一个进化分枝。结论 KM4/2011分离株为HRV A22型,存在地域差异。     

2015—2018年北京市东城区甲型H1N1pdm09亚型流感病毒分子流行病学特征分析

目的 分析2015—2018年北京市东城区甲型H1N1pdm09亚型流感病毒的分子流行病学特征。方法 收集2015年1月1日—2018年12月31日期间北京市东城区流感样病例的咽拭子样本,RT-PCR法检测核酸,阳性样本接种至MDCK细胞进行病毒分离,血凝抑制试验鉴定流感亚型。选取30株甲型H1N1pdm09亚型分离株,RT-PCR法扩增血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因序列,并测序。应用DNASTAR 5.0软件将HA、NA序列进行拼接,MEGA 6.0软件建立系统进化树,并进行遗传特征分析。结果 共检测样本7 533份,甲型H1N1pdm09亚型231份,阳性率为23.24%。30株甲型H1N1pdm09亚型分离株与WHO推荐的北半球疫苗株A-Brisbane-02-2018的HA基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.42%～99.53%和97.40%～99.32%;NA基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.11%～99.74%和97.72%～99.80%。HA基因共有16个氨基酸位点发生改变,NA基因共有10个位点发...     

2019年云南省昆明市柯萨奇病毒A组16型毒株的分离鉴定及其VP1基因遗传特征分析

目的 对2019年云南省手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）患者粪便中分离获得的柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CVA16）毒株的全VP1基因遗传特征进行分析。方法 使用人胚肺二倍体KMB-17细胞和非洲绿猴肾Vero细胞分离病毒,设计针对CVA16全VP1基因序列引物,采用RT-PCR扩增目的基因片段并测序;利用MEGA 7.0和Geneious 9.0.2等软件对全VP1序列进行分析。结果 共分离获得26株CVA16毒株,其中有8株KMB-17分离株和18株Vero分离株。随机选取20株CVA16分离株进行分析,发现3株B1a和17株B1b基因亚型;其中17株CVA16 B1b分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.8%～100%和98.3%～100%,与国内其他分离株的核苷酸和氨基酸同源性为91.1%～99.2%和97.3%～99.0%;3株B1a分离株的核苷酸和氨基酸同源性为98.0%～98.1%和99.3%,与国内其他B1a分离株的核苷酸和氨基酸同源性为88.7%～98.7%和98.3%～99.7%;17株B...     

肠道病毒71型Lanzhou01株的分离及其生物学特性

目的对肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)Lanzhou01株进行分离、鉴定,并分析其生物学特性,为EV71疫苗候选毒株的筛选奠定基础。方法从兰州市手足口病患者的粪便样本中分离EV71,经蚀斑克隆传代后,RT-PCR法检测其特异性;Vero细胞甲基纤维素蚀斑法分析病毒的毒力;克隆病毒的VP1基因,进行序列测定及分析;扫描电镜观察病毒的形态;以不同的MOI接种Vero细胞,观察细胞病变,并绘制病毒的增殖曲线;连续传代,分析VP1基因和氨基酸序列,并测定毒力,检测其遗传稳定性。结果经细胞传代和蚀斑克隆,获得增殖性能稳定的分离株,RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析可见约250bp的特异性条带;经VP1基因测序与进化树鉴定为EV71,其与浙江、深圳等地的EV71分离株的核苷酸序列同源性均大于99%,属于C4基因亚型;电镜下观察病毒颗粒为球形,直径20～30nm;该病毒在Vero细胞上培养后产生典型的细胞病变,毒力为6.8LgPFU/ml;经Vero细胞连续传30代,不同代次的病毒VP1基因序列的核苷酸序列同源性大于或等于99.6%,氨基酸序列几乎没有明显变异,毒力也无明显改变。结论已成功分离1株EV71,其生物学特性良好,为灭活疫苗的研制及疫苗候选株的筛选奠定了基础。     

33株柯萨奇病毒A组16型分离株的全基因序列分析

目的对2008～2010年北京和青岛地区流行的33株柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CA16)分离株的全基因序列进行分析。方法收集2008～2010年北京和青岛地区CA16感染患者咽拭子标本,采用Vero细胞对病毒进行分离,并经噬斑纯化。提取病毒RNA,采用RT-PCR法分段扩增CA16全长基因,经序列测定和拼接后,利用DNAStar和MEGA5.10软件分析全基因序列。结果经病毒分离和噬斑纯化,共获得33株CA16分离株;33个分离株之间的核苷酸序列同源性大于90.9%,与CA16国际标准株G10各区段的核苷酸序列同源性为72.7%～89.0%,氨基酸序列同源性为79.3%～100.0%;与近年中国分离的CA16 SZ/HK08-7株同源性较高,全基因组同源性大于91.5%,各区段核苷酸序列同源性均大于83.7%;在基于VP1序列的种系进化树中,BJWG16、BJWG17、BJWG20等23个分离株属于C1亚型,其余10个分离株属于C3亚型。结论 2008～2010年北京和青岛地区流行的33株CA16分离株均为C基因型。本研究对我国CA16分子流行病学、毒力位点的研究以及疫苗株的选择具有重要意义。     

鹅细小病毒VP3基因的克隆及序列分析

目的克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)黑龙江各分离株和疫苗株的VP3基因,并进行序列分析,为小鹅瘟的诊断与防治奠定理论基础。方法根据GenBank中登录的GPV B株全基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增、克隆VP3基因,并进行测序和同源性分析。结果克隆的VP3基因大小699 bp,编码233个氨基酸;7个分离株的VP3基因核苷酸序列同源性为99.4%～100%,各分离株与疫苗株的核苷酸序列同源性为98.7%～99.3%,与标准B株的核苷酸序列同源性为97.6%～97.7%,与MDPV核苷酸序列的同源性为80.8%～81.7%;各分离株之间亲缘关系较近,其中QTH分离株与疫苗株亲缘关系最近,氨基酸序列同源性为97.8%,其他分离株与疫苗株的亲缘关系相对较远,氨基酸序列同源性为96.6%～97.4%;所有分离株和疫苗株与标准B株亲缘关系相对较远,与MDPV的亲缘关系最远。结论黑龙江省各分离株与疫苗株的核苷酸和氨基酸序列存在一定的差异。     

2007年吉林省散发野型麻疹病毒H基因序列分析

目的分析2007年吉林省散发野型麻疹病毒的基因型别和特征。方法对2007年吉林省分离到的3株散发麻疹野型病毒,经RT-PCR扩增血凝素(H)基因片段,克隆到pMD19-T载体,进行酶切鉴定及序列测定,并分析核苷酸序列,与GenBank中麻疹病毒的22个代表株H基因序列的同源性进行比较。结果RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,可见大小约为570bp的片段,克隆至pMD19-T载体后,酶切鉴定结果与预期相符。3株麻疹病毒均属H1基因型,其H基因之间同源性为98.5%～99.6%,与其他已知麻疹病毒的22个基因代表株相比,在核苷酸水平上最大变异为9.7%。3株病毒与H1a参考株Chin93-2、H1b参考株Chin94-5和H1c参考株Chin94-7的平均遗传距离分别为0.007～0.015、0.013～0.021和0.015～0.023。结论H1a基因型毒株是导致吉林省2007年春季麻疹散发的优势毒株。     

浙江新分离狂犬病病毒街毒株与国内外疫苗株G基因的比较分析

目的对浙江新近分离的2株狂犬病病毒街毒株的G基因进行遗传学分析,并比较其与国内外使用的狂犬病疫苗株间的差异。方法以直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法检测伤人犬脑组织,乳鼠接种分离病毒,RT-PCR扩增G基因片段,直接测序后进行遗传学分析。结果在2份伤人犬脑组织(编号LH和ZJCA1)中均检出狂犬病病毒,与其他浙江街毒株相比,G基因核苷酸和氨基酸序列同源性均为98.7%～99.2%。与当前国内外使用的多种疫苗株相比,与CTN疫苗株同源性最高,G基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.5%～86.1%和86.8%～94.1%。结论浙江新分离的2株狂犬病病毒街毒株属于基因1型,与当前使用的多种疫苗株相比,与CTN疫苗株属于同一分支,二者的亲缘关系最近。     

IL-2、15、22基因对CVB3 VP1 DNA疫苗免疫效果的影响

目的观察白细胞介素2(Interleukin2,IL2)、白细胞介素15(Interleukin15,IL15)和白细胞介素22(Interleukin22,IL22)基因对柯萨奇病毒(CoxasckievirusB3,CVB3)VP1DNA疫苗诱导小鼠免疫应答及保护作用的影响。方法取雄性BALBc小鼠,随机分为6组,每组20只,分别肌内注射盐水、pcDNA3、pcDNA3VP1、pcDNA3IL2+pcDNA3VP1、pcDNA3IL15+pcDNA3VP1和pcDNA3IL22+pcDNA3VP1,每周1次,共3次,每次免疫后6d取血清用微量中和试验检测CVB3中和抗体,3次免疫后用800TCID50CVB3感染小鼠,观察小鼠的生存时间和生存率。结果pcDNA3VP1、pcDNA3IL2+pcDNA3VP1和pcDNA3IL15+pcDNA3VP1组均能诱导小鼠产生中和抗体,抗体滴度随免疫次数增加而提高。病毒攻击后,各组的生存率差异无显著意义,pcDNA3IL2+pcDNA3VP1和pcDNA3IL15+pcDNA3VP1组较其他4组生存时间明显延长。pcDNA3IL22+pcDNA3VP1组虽也能诱导小鼠产生中和抗体,但抗体滴度和生存情况无明显变化。结论IL2、IL15基因对CVB3VP1DNA疫苗诱导小鼠产生免疫应答和免疫保护有一定的增强作用,而IL22基因无明显作用。     

柯萨奇B4病毒jlu06株基因序列及遗传进化分析

目的对柯萨奇B4病毒(CVB4)jlu06株进行基因序列及遗传进化分析,并探讨其与致病相关的分子基础。方法Trizol法提取病毒RNA,RT-PCR扩增目的基因片段,测定基因组全序列,并进行序列同源性及遗传进化分析。结果CVB4 jlu06株基因组全长7 395个核苷酸,编码2 183个氨基酸,与其他CVB4株的同源性较高,且发生了10个氨基酸的变异,与HumanCB4和POLG_CXB4亲缘关系较近,与CXB2亲缘关系较远;CVB4 jlu06株与具有潜在致糖尿病性病毒株,在非结构蛋白3A区4个位点有共同的氨基酸,与非致病毒株不同。结论CVB4 jlu06株具有典型的CVB4基因组特征,在非结构蛋白3A区发生的核苷酸和氨基酸变异可能与其致病性相关。