Vero细胞培养流感病毒的低血清培养基的筛选

目的筛选Vero细胞生长的最适低血清培养基,用于流感病毒的细胞培养。方法分别以MEM、M199、DMEM/F12、DMEM/F12与MEM混合物(1∶1)为基础培养基,添加5%、2%、1%的小牛血清传代培养Vero细胞,通过细胞形态观察、细胞计数及MTT法检测细胞的增殖活力筛选最适基础培养基;将流感病毒接种低血清适应的Vero细胞,检测病毒收获液的血凝效价及残留BSA含量,电子显微镜观察病毒形态。结果以DMEM/F12与MEM混合物(1∶1)为基础培养基,添加2%小牛血清培养的Vero细胞长势良好,细胞数量较多,增殖活力最强。低血清适应的Vero细胞培养的流感病毒血凝效价最高可达1∶512,平均值为1∶384;病毒液中的残留BSA含量约为正常血清培养条件下的1/18;病毒形态完整。结论成功筛选出Vero细胞培养流感病毒的低血清培养基,为更具生物安全性的流感疫苗的研发奠定了基础。     

麻疹血凝素效价的稳定性

<正> 麻疹血凝素(HA)是检测麻疹血凝抑制(HI)抗体水平的试剂之一。 本实验室1985年用原代人羊膜细胞和传代人羊膜(FL)细胞分别制备了若干批麻疹粗制血凝素,保存于-28℃冰     

流感病毒H5N1在Vero细胞上培养条件的优化

目的优化流感病毒H5N1在Vero细胞上的培养条件。方法在Vero细胞上,用不同维持液[M199、M199+表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)、MEM、MEM+EGF、无血清培养基(serum-free medium,SFM)]及含不同胰酶浓度(3、5、7μg/ml)的M199维持液培养流感病毒H5N1,收获培养上清,检测血凝滴度,确定最适维持液及胰酶浓度;用流感病毒H5N1感染细胞上清于冻融前后分别感染Vero细胞,连续传代,收获培养上清,检测血凝滴度,比较冻融对病毒增殖的影响。将流感病毒H5N1以0.01 MOI感染对数生长期Vero细胞,以优化后的培养条件培养,收获培养上清,检测血凝滴度及病毒感染性滴度,确定H5N1在Vero细胞上连续传代的稳定性。结果当维持液培养基为SFM、胰酶浓度为5μg/ml时,利用病毒收获液直接感染2代后,再将维持液培养基更换为M199时,血凝滴度最高。利用优化后的培养条件在Vero细胞上连续传代培养流感病毒H5N1,血凝滴度和感染性病毒滴度均较稳定。结论优化后的培养条件在Vero细胞上可连续稳定传代培养流感病毒H5N1,为建立工作种子批,用于大流感疫苗的制备奠定了基础。     

利用DNA免疫技术制备麻疹病毒抗血清

目的利用DNA免疫技术制备特异性麻疹病毒抗血清,用于麻疹减毒活疫苗毒种以及含麻疹病毒疫苗的检定。方法以含麻疹病毒沪-191融合蛋白F和血凝素H基因的重组真核表达载体pGI-F和pGI-H作为免疫原,免疫家兔,制备麻疹病毒抗血清。采用细胞培养法检测抗血清细胞毒性,ELISA法检测抗体滴度,微量细胞病变法检测抗血清的特异性和中和效价。结果麻疹病毒抗血清细胞毒性小,与风疹病毒、腮腺炎病毒、水痘病毒均无交叉反应。抗血清的ELISA效价大于256 000,中和效价为1∶1 024,4倍稀释后仍能完全中和1×10~5 CCID_(50)/ml麻疹病毒。结论 DNA免疫方法可制备高效价、低细胞毒性的麻疹病毒抗血清,该血清可用于麻疹疫苗毒种及含麻疹疫苗的质量控制。     

高效价麻疹抗血清的制备及检定

目的制备高效价麻疹抗血清,用于疫苗检定中病毒鉴别、支原体检测、麻腮二联和麻腮风三联疫苗的联合滴定试验。方法将麻疹病毒L4株于Vero细胞中传代培养,获得高滴度病毒原液,制备免疫抗原,分别经腹腔注射法、耳静脉注射法和背部皮下多点注射法免疫家兔,制备抗血清,并按规程要求对抗血清进行检定。结果采用腹腔注射法、耳静脉注射法和背部皮下多点注射法免疫家兔所制备的抗血清的中和效价分别为1∶960、1∶2 560和1∶3 840,经检定,3种方法制备的抗血清均达到疫苗检定的使用要求。结论背部皮下多点注射法制备的麻疹抗血清效价最高,且操作简单,可作为制备高效价麻疹抗血清的最佳方案。     

低血清培养Vero细胞和流感病毒条件的优化

目的优化低血清培养Vero细胞和流感病毒的条件,为开发Vero细胞流感疫苗奠定基础。方法分别在DMEM/F12和SLM-199培养基中,添加不同浓度的血清,培养Vero细胞,观察细胞连续传代的生长状态;接种流感病毒后,检测病毒培养液不同pH值、不同浓度TPCK-胰酶和病毒不同接种量对病毒血凝效价的影响。结果用SLM-199在1.0%血清浓度下培养的Vero细胞接种流感病毒血凝效价较高,病毒培养液pH值为7.2,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,接种病毒MOI为1.0时,72h收获的病毒血凝效价最高。结论已筛选出低血清培养Vero细胞和流感病毒的适宜条件。     

改良M199培养基在Vero细胞培养中的适用性

目的比较改良M199培养基与进口M199培养基培养Vero细胞及狂犬病病毒的效果,旨在筛选出更适合Vero细胞生长及其相关病毒培养的培养基。方法分别用含5%新生牛血清的改良M199培养基和进口M199培养基培养Vero细胞,于倒置显微镜下观察细胞的生长状态,并进行细胞计数,台盼蓝染色法测定细胞活力;分别用含1%新生牛生血清的改良M199培养基和进口M199培养基培养狂犬病病毒,采用小鼠脑内滴定法测定病毒滴度。结果改良M199培养基培养的Vero细胞形态更规则,增殖更快,细胞密度和活力均高于进口M199培养基培养的Vero细胞;使用改良M199培养基培养狂犬病病毒,病毒增殖更快,滴度更高,峰值可达109log LD50/ml,明显高于使用进口M199培养基培养的病毒滴度。结论改良M199培养基更适合Vero细胞以及狂犬病病毒的培养。     

无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立

目的建立无血清培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株的工艺。方法分别采用VP-SFM和含5%牛血清DMEM于方瓶中培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株,比较无血清培养基培养不同代次Vero细胞间及无血清与含血清培养基培养Vero细胞间制备的狂犬病病毒滴度及效力。将2 g/L微载体cytodex-1加至250 ml spinner flask中,加入Vero细胞,37℃培养3 d,按MOI=0.02接种狂犬病病毒CTN-1V株,检测病毒收获液的病毒滴度及效力,每天显微镜下观察细胞生长情况,计算细胞比生长速率。结果无血清培养基培养不同代次Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度和效力差异无统计学意义(P0.05);无血清和含血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度差异无统计学意义(P0.05),但无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒效力明显高于含血清的培养基(P0.05)。搅拌瓶微载体系统培养Vero细胞制备狂犬病病毒,细胞贴壁均匀,生长良好,收获病毒液的平均病毒滴度为6.50 lg FFU/ml,平均病毒效力为6.77 IU/ml。结论初步建立了微载体系统无血清培养Vero细胞制备狂犬病病毒的工艺,为无血清规模化制备狂犬病疫苗奠定了基础。     

Vero细胞生物反应器微载体无血清培养甲型流感病毒

目的 采用Vero细胞生物反应器微载体无血清培养甲型流感病毒。方法 将Vero细胞分别采用无血清和有血清培养基于生物反应器(pH 7.2,温度37℃,溶氧量50%,转数60 r/min)中培养24 h,均用无血清培养基进行灌流培养至7 d,进行计数,并按MOI=0.1接种H1N1型流感病毒,加入终浓度为1μg/mL的TPCK-胰酶,于生物反应器(pH 7.8,温度33.0℃,溶氧量25%,转数60 r/min)中培养18、22、42、48、66 h,取样,检测血凝效价。结果 Vero细胞经无血清和有血清培养基培养7 d的细胞数分别为(133.4±2.0)×10⁴和(193.8±1.3)×10⁴个/mL,接种H1N1流感病毒66 h后血凝效价几何平均数分别为1∶388和1∶675,前者细胞数及病毒血凝效价几何平均数均显著低于后者(t分别为7.068和4.332,P均<0.05)。结论 采用Vero细胞通过生物反应器微载体无血清培养H1N1型流感病毒的血凝效价可满足流感病毒裂解疫苗制备的要求。     

水痘-带状疱疹病毒在Vero细胞中的传代培养及抗水痘血清的制备

目的在Vero细胞中传代培养水痘-带状疱疹病毒(varicella-herpes zoster virus,VZV),并制备抗水痘血清。方法将VZV(北京株VZV84-2)在Vero细胞中传代培养,待细胞病变(CPE)稳定后制备抗原,分别免疫家兔(分为1组和2组)和豚鼠(仅1组),均免疫4次,每次间隔14 d,其中除家兔1组第3、4次免疫经耳静脉注射不含佐剂的免疫原外,其他均经背部皮下免疫含弗氏完全佐剂的免疫原。于末次免疫后2周经颈动脉采血,分离血清,进行无菌试验、中和抗体效价检测及特异性干扰试验。结果 VZV(北京株84-2)在Vero细胞中传至第5代时,CPE可达80%~90%,传至第10代时,CPE稳定。用含兔及豚鼠血清培养基制备的免疫原的蛋白含量分别为2.1和1.7 mg/ml。抗血清无菌检测合格;家兔1组、豚鼠组、家兔2组的血清中和抗体效价分别为1∶128、1∶256、1∶64;抗水痘血清对麻疹(沪191株)、腮腺炎(S79株)、风疹(BRDⅡ株)疫苗的滴定无干扰。结论成功将VZV在Vero细胞中进行传代培养,并制备了抗水痘血清,但效价较低,有待进一步提高。     

肠道病毒71型在Cellspin系统中无血清微载体培养工艺的建立

目的建立肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)在Cellspin系统中无血清微载体培养工艺,为生物反应器培养EV71工艺的建立奠定基础。方法在Cellspin培养系统中对Vero细胞进行微载体培养,考察不同种类培养基MEM、DMEM/F12、VP-SFM、Opti-SFM、Opti-pro、MD505-199及不同微载体浓度3、5、10 g/L对细胞密度的影响。分别以MOI为0.2及2.0接种EV71至Vero细胞,考察病毒接种量对病毒增殖的影响。分别按培养上清、微载体洗脱液模式收毒,比较不同组分中EV71的抗原含量及TCID50。结果采用5 g/L微载体、VP-SFM培养基时,Vero细胞的密度达4.40×106个/ml;按MOI为2.0染毒,72 h后即可收毒,较MOI为0.2的收毒时间早48 h,按MOI为0.2染毒,收获液上清中的抗原含量达193.5 U/ml,病毒滴度达8.43 Log10TCID50/ml;按上清加洗脱液模式收毒,抗原含量可达573 U/ml。结论成功建立了无血清微载体培养Vero细胞生产EV71的方法,为生物反应器培养EV71工艺的建立奠定了基础。     

北京株水痘活疫苗的研制

选择处于对数生长期的人胎肺二倍体细胞（2BS），接种北京-7株水痘-带状疱疹病毒．待受染病毒的细胞出现CPE时，将维持液换为不含牛血清的MEM。接种后的2M细胞，培育36～38小时即可收获较高满度的病毒。采用pH7．2～7．4含25％山梨醇作保护剂、以6000r／min离心30分钟除去病毒液中的细胞碎片，制成减毒活疫苗。     

Vero细胞森林脑炎疫苗毒种的选育及其生物学特性检测

目的选育Vero细胞森林脑炎疫苗适应毒种。方法将森林脑炎疫苗鼠脑病毒“森张”株在Vero细胞上连续传代适应,并对不同代次收获的病毒液的病毒滴度、免疫原性、稳定性等进行检测。结果“森张”株病毒在Vero细胞上传代适应后,病毒滴度达8·5LgLD50/ml;免疫血清中和抗体效价高于1∶20,其它检测项目均符合疫苗生产用毒种的要求。结论Vero细胞适应的“森张”株毒种的初步特性显示可作为制备Vero细胞森林脑炎疫苗用毒种。     

生物反应器培养Vero细胞生产肠道病毒71型

目的研究利用微载体技术规模化制备肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的方法。方法利用NBSCelliGen 310 5 L生物反应器进行Vero细胞微载体培养,考察了不同微载体Cytodex-1浓度(3、10、15、20 g/L)对Vero细胞生长代谢及细胞密度的影响,并且与细胞工厂(Cell factory,CF)中Vero细胞染毒后的病毒繁殖进行比较。分别采用上清液、洗涤液、洗脱液模式收毒,比较不同收毒方式中EV71的抗原含量及病毒滴度(CCID50)。结果采用10 g/L微载体浓度,批次培养方式培养Vero细胞120 h后,细胞密度可达5.47×106个/ml;当微载体浓度大于15 g/L时,由于葡萄糖消耗速度快,需采用灌注模式培养。按MOI 0.2染毒后,微载体培养的收毒时间比CF慢48 h,但其病毒滴度可达8.8 Log10CCID50/ml,约为CF的5倍。EV71与微载体存在离子交换吸附作用,按上清液加洗脱液方式收毒,抗原总量可达12 61 U/ml,约为CF的3倍。结论已成功建立了生物反应器微载体5 L发酵培养Vero细胞生产EV71的方法,为进一步EV71大规模培养以及疫苗研发奠定了基础。     

两种细胞培养流感病毒的滴度比较

目的探讨甲1(A1)型流感病毒在Vero细胞和MDCK细胞培养的可行性,确定最佳培养条件。方法将流感病毒接种于Vero细胞和MDCK细胞,在含有不同浓度胎牛血清或胰酶维持液中培养,于不同时间收获病毒液,检测血凝素滴度(HA)。结果胎牛血清对病毒的繁殖有明显抑制作用。加入适量胰酶(约5μg/ml)可提高病毒产量。最佳收获病毒时间为72～96h。在MDCK细胞上的病毒HA滴度高于Vero细胞。结论两种组织细胞培养流感病毒结果相近,Vero细胞和MDCK细胞均可用于培养流感病毒。     

SARS病毒NS-1株三级毒种库的建立

目的建立SARS病毒NS1株三级毒种库。方法SARS病毒NS1株在Vero细胞上传代扩增,并经各项检定合格后,建立SARS病毒NS1株三级毒种库。结果工作种子批病毒滴度均在8.2LgCCID50ml以上;无菌试验、支原体检查均合格;鉴别试验中,经与SARS病人恢复期高效价血清中和,中和指数均在955以上;外源因子检查中,小鼠和乳鼠存活率均在86%以上;血吸附和非血吸附检查均为阴性;免疫原性检查中,病毒原液和1∶5倍稀释病毒液免疫小鼠,其血清中和效价分别达1∶54和1∶15。结论SARS病毒NS1株各项指标均符合《SARS病毒灭活疫苗临床前研究技术要点》和《中国生物制品规程》2000年版要求,可作为SARS灭活疫苗生产用毒种。     

黄热疫苗病毒17D株在Vero细胞上的适应性传代

目的建立黄热疫苗病毒17D株的Vero细胞适应株。方法将2批鸡胚黄热疫苗病毒在Vero细胞上进行2次蚀斑筛选,并连续传代培养,然后对获得的4株Vero细胞适应株病毒YFV-Vero(5)-A1、YFV-Vero(5)-A2、YFV-Vero(5)-B1和YFV-Vero(5)-B2进行稳定性和免疫原性检测。结果4株Vero细胞适应株病毒可被黄热病毒(17D)猴免疫血清中和。在传代过程中,不同代次的病毒滴度稳定在6·90LgPFU/ml以上,高峰病变出现时间为5~7d。家兔和小鼠的免疫血清中和抗体效价分别为1∶640~1∶5120和1∶640~1∶2560。结论4株Vero细胞适应株病毒生物学性状稳定,免疫原性良好。     

Vero细胞制备流感病毒疫苗

目的利用转瓶培养Vero细胞制备流感病毒疫苗。方法将流感病毒接种于Vero细胞上培养,优化培养条件,收获的病毒液经灭活、超滤浓缩和层析纯化,检测病毒的血凝素(HA)滴度及血凝素含量。按此工艺制备流感疫苗,根据血凝素含量稀释为不同浓度,免疫小鼠,观察不良反应,并通过血凝抑制(HI)试验检测抗体水平。结果Vero细胞培养流感病毒的最佳条件为:维持液中胰酶浓度12.5～15μg/ml,pH值7.4～7.6,Vero细胞经多次洗换后再接种病毒,病毒在细胞上培养72～96h收毒。所有免疫小鼠均未出现不良反应,小鼠抗体阳转率均为100%,HI抗体滴度均不低于同剂量的阳性对照组。结论Vero细胞可用于流感病毒的培养和制备疫苗。