重组汉逊酵母表达的乙型肝炎病毒表面抗原疏水层析图谱的峰形规律分析

目的探讨疏水层析纯化重组汉逊酵母(Hansenula polymorpha,HP)表达的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)层析图谱与蛋白含量及HBsAg含量的相关性。方法采用疏水层析纯化8批HP-HBsAg小量试验样品和5批小量验证试验样品及5批酿酒酵母表达的HBsAg对照试验样品,采用Lowry法和电化学发光法(Electrochemiluminescentimmunoassay,ECLIA)分别检测纯化样品中蛋白含量和HBsAg含量,并计算HBsAg的回收率;通过几何法封闭紫外监测图谱特征峰图形,用数字求积仪采用积分法求出各封闭特征峰的图形面积,并进行分析;取小量验证试验1批样品的层析主峰和副峰收液进行电镜观察。结果 8批HP-HBsAg小量试验和5批HP-HBsAg小量验证试验HBsAg的平均回收率分别为70%和54%。HP-HBsAg疏水层析图谱由两部分构成:穿透峰和目标峰(HBsAg峰),目标峰可见高低不同的两个峰(主峰与副峰);对照图谱中有穿透峰和目标峰。对目标峰进行量化分析,主峰、副峰与目标峰的面积比值分别与其所对应的收集量、蛋白含量和HBsAg含量比值相关。电镜观察可见小量验证试验样品主峰收液中HBsAg颗粒大小均一,副峰收液中HBsAg颗粒大小不均一。结论疏水层析纯化重组HP表达的HBsAg效果良好,通过峰形之间面积比值,可获得峰形所对应的收集量、蛋白量和HBsAg量比值,为HBsAg的进一步纯化提供了参考。     

重组HBsAg在汉逊酵母中的分泌表达

目的构建重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)分泌型汉逊酵母工程菌株,并进行诱导表达。方法在HBsAg基因前加酿酒酵母α前导肽(MFα)基因序列作为信号肽,将整个序列优化为汉逊酵母优选密码子,采用搭桥PCR方法分别合成后,通过1对引物PCR法融合在一起。将融合基因插入汉逊酵母穿梭质粒pDGXHP2.0的甲醇氧化酶基因(MOX)启动子下游,构建成多拷贝分泌型重组表达载体。将其电转化多型汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主菌ATCC34438(Ura3-),筛选分泌表达HBsAg的汉逊酵母工程菌株,并比较在YPD、BMMY、MM3种培养基中分泌表达HBsAg的水平,ELISA检测培养上清液中HBsAg的表达量,透射电镜观察类病毒颗粒(VLPs)。结果构建了HBsAg汉逊酵母多拷贝表达质粒pDGXHP2.0-2MFα-HBsAg和pDGXHP2.0-4MFα-HBsAg,筛选获得了分泌表达HBsAg的汉逊酵母HP/2MFα-HBsAg和HP/4MFα-HBsAg。经诱导,工程菌株在YPD培养基中分泌表达的HBsAg量高于在BMMY和MM中的表达量;ELISA定量检测表达量最高可达10μg/ml,培养上清液经透射电镜观察,形成了VLPs。结论HBsAg在汉逊酵母中能够分泌表达,并能形成VLPs,但表达量低于胞内表达量。     

重组汉逊酵母表达的HBsAgP24亚基间二硫键桥联程度等生化性状分析

目的分析重组汉逊酵母(Hansenula polymorpha,HP)表达的HBs Ag(HP-HBs Ag)P24亚基间二硫键桥联程度等生化性状。方法采用蔗糖垫层离心法检测HBs Ag的浮力密度,SDS-PAGE分析HBs Ag P24亚基间结合程度的变化,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析HBs Ag VLP在硫氰酸盐处理前后百分含量的变化。以酿酒酵母(Saccharomyces cervesiae,SC)表达的HBs Ag(SC-HBs Ag)作为对照。结果 HP-HBs Ag的浮力密度为(1.085±0.014)g/ml,与SC-HBs Ag的浮力密度[(1.090±0.009)g/ml]接近。SDS-PAGE分析表明,未经硫氰酸盐处理时,HP-HBs Ag不能进入分离胶,而SC-HBs Ag能进入分离胶;经硫氰酸盐处理后,HP-HBs Ag和SCHBs Ag均不能进入分离胶。HPLC分析表明,流动相中含SDS时,HP-HBs Ag VLP的百分含量在经硫氰酸盐处理前后变化不明显,SC-HBs Ag VLP的百分含量在经硫氰酸盐处理后较处理前升高;在经硫氰酸盐处理前后,HP-HBs Ag VLP的百分含量均高于SC-HBs Ag。结论 HP-HBs Ag的浮力密度与SC-HBs Ag相近,HP-HBs Ag P24亚基间二硫键桥联程度较高,结合紧密,不需要经硫氰酸盐处理。     

表达乙型肝炎表面抗原重组汉逊酵母细胞破碎率的检测

目的建立快速检测表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)重组汉逊酵母细胞破碎率的方法。方法分别以显微镜计数法和染色后毛细管离心法检测表达HBsAg的重组汉逊酵母细胞破碎率,并采用Lowry法检测细胞破碎前后上清液中蛋白质含量,以间接评价细胞破碎率。3种方法均以表达HBsAg的重组酿酒酵母细胞作为对照。结果显微镜计数法可直接计算出细胞的破碎率,结果可靠,但不同人员检测数据存在差异;毛细管离心法检测细胞破碎率结果与显微镜计数法接近,且较显微镜计数法稳定,汉逊酵母细胞破碎悬液经考马斯亮蓝染色效果较好;Lowry法检测细胞破碎后的蛋白释出度与细胞破碎率呈对应性。结论 3种实验方法均可评价细胞破碎率,毛细管离心法快速简便,在实际生产过程中较为实用。     

重组人胃蛋白酶原Ⅰ在汉逊酵母中的分泌表达、纯化及其应用

目的实现人胃蛋白酶原Ⅰ(pepsiongenⅠ,PGⅠ)在汉逊酵母表达系统中的高效分泌表达,并将纯化的重组PGⅠ蛋白制备成体外诊断试剂用校准品。方法根据汉逊酵母遗传密码子偏爱性优化设计并合成PGⅠ基因,克隆至表达载体p RMHP2.1中,电转化汉逊酵母宿主菌26012,进行多次传代及稳定,筛选高水平分泌表达PGⅠ的菌株,并对该菌株的目的基因整合位置及整合拷贝数进行检测。应用200 L发酵罐大规模制备发酵培养液,通过Ni柱亲和层析方法纯化获得重组PGⅠ蛋白,经胶乳增强免疫比浊试剂盒进行PGⅠ蛋白的定值,应用类血清基质液制备100及50μg/L浓度的PGⅠ校准品后检测稳定性。结果重组表达质粒p RMHP2.1-PGⅠ经双酶切及测序鉴定证明构建正确。筛选获得的重组汉逊酵母菌株分泌表达的PGⅠ蛋白相对分子质量约45 000,表达量达100 mg/L以上,其外源基因整合于宿主r DNA位置,整合拷贝数不低于20个。纯化后的重组PGⅠ蛋白纯度为94.5%,配制后的PGⅠ校准品经4℃实时保存稳定性、37℃加速破坏性及4℃开盖保存稳定性试验,校准品定值的平均下降幅度均不超过10%。结论应用汉逊酵母表达系统可高效分泌PGⅠ蛋白,该蛋白具有良好的稳定性,可用作体外诊断试剂的PGⅠ校准品。     

应用国产激流式生物反应器培养表达HBsAg的重组CHO细胞

目的采用国产激流式生物反应器培养表达HBsAg的重组CHO细胞。方法分别应用美国NBS公司的Celligen310型生物反应器和国产AP20SC型激流式生物反应器(单个细胞培养袋和4个细胞培养袋)连续灌流培养重组CHO细胞,连续培养35 d,每24 h收获1次,采用ELISA法测定细胞收获液中HBsAg的滴度。结果 Celligen 310型生物反应器培养重组CHO细胞分泌的HBsAg在2.0μg/ml水平上可持续8 d,至第18天达最高水平(2.16μg/ml),第35天收液中HBsAg含量为1.12μg/ml;国产AP20SC激流式生物反应器单个细胞培养袋培养重组CHO细胞分泌的HBsAg在2.0μg/ml水平上可持续9 d,第18天达最高水平(2.20μg/ml),第35天收液中HBsAg含量为1.08μg/ml,与Celligen 310型生物反应器相比,收液中HBsAg含量在2.0μg/ml水平持续时间无明显差异;国产AP20SC激流式生物反应器4个细胞培养袋培养重组CHO细胞分泌的HBsAg在2.0μg/ml水平上可持续13 d,与该生物反应器单个细胞培养袋相比明显延长,第21天达最高水平(2.14μg/ml),第35天收液中HBsAg含量为1.5μg/ml,明显高于单个细胞培养袋培养的细胞。结论国产AP20SC型激流式生物反应器可代替进口生物反应器对传代细胞进行大规模培养,用于人用疫苗的生产。     

多拷贝重组HBsAg质粒的构建及在毕赤酵母中的高效表达

目的通过构建多拷贝数表达质粒,获得高表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。方法通过对单拷贝表达质粒进行改造,将表达盒(5′AOX-HBsAg-TT)重复导入载体,构建多拷贝数表达质粒。通过电转化、15L规模发酵和纯化,获得纯化HBsAg颗粒,并对表达产物的特异性、免疫原性及表达量与拷贝数间的关系进行分析。结果多拷贝数重组毕赤酵母的表达产物经ELISA、SDS-PAGE、Western blot检测,显示出良好的特异性,电镜观察证明表达产物能够自发装配成22nm类病毒颗粒(VLP),其表达量与拷贝数呈正相关,拷贝数提高未对菌体正常生长带来影响,HBsAg制备的免疫原能有效刺激小鼠产生保护性抗体。结论含多拷贝数表达质粒的工程菌可显著提高毕赤酵母HBsAg表达量。     

转人HLA-A2基因小鼠对adr亚型重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)的免疫应答

目的对汉逊酵母表达的adr亚型重组乙型肝炎(简称乙肝)疫苗(adr疫苗)进行免疫学特性与功能学研究。方法采用adr疫苗与酿酒酵母表达的重组乙肝疫苗(adw疫苗)免疫转人HLA-A2基因小鼠,免疫剂量2μg/0.2 ml,于初免3周后进行第2次免疫。于第2次免疫1周后,采血,分离血清,经ELISA法检测小鼠血清中抗-HBs抗体水平。同时取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,采用HLA-A2/WLSLLVPFV五聚体荧光标记流式细胞术分析细胞中特异性抗乙肝病毒表位的CTL比例。结果 adr疫苗与adw疫苗均可诱导转基因小鼠产生抗乙肝表面抗原抗体,且抗体水平差异无统计学意义(P>0.05),2种疫苗对转基因小鼠的体液免疫应答的增强作用相似;adr疫苗诱导的乙肝表面抗原特异性CTL应答作用较adw疫苗更明显(P<0.05)。结论 adr重组乙肝疫苗(汉逊酵母)诱导转基因小鼠的体液免疫应答作用与现有adw疫苗相似,但其诱导机体产生细胞免疫应答的能力更显著,可能具有更加良好的预防HBV感染作用和前景。     

纯化乙型肝炎病毒表面抗原新层析工艺的建立

目的建立提高乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)纯度和收率的新工艺。方法采用微滤法、疏水层析、“穿透式”阴离子交换层析、硫酸纤维素亲和层析和凝胶过滤层析进行HBsAg的纯化。结果采用新建立的工艺,HBsAg收率在50%以上,纯度大于95%,各项检定结果均符合《中国药典》三部(2005版)要求。结论新工艺提高了HBsAg的纯度和收率,适用于规模化生产。     

重组乙型肝炎疫苗工艺中去除甲醛添加的探讨

目的通过比较甲醛处理前后重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和疫苗(汉逊酵母)成品各项检测指标及稳定性的变化,评估甲醛在重组乙型肝炎疫苗工艺中的作用,为重组乙型肝炎疫苗工艺中是否可取消甲醛处理步骤提供参考。方法采用扫描电镜观察、HPLC检测和疫苗体内效力评价指标半数有效剂量(ED_(50))、乙肝疫苗常规检测项目比较甲醛处理前后HBsAg及疫苗成品的变化情况,通过稳定性考察确定甲醛对疫苗稳定性和有效期的影响。结果 HBsAg经甲醛处理后产生轻微聚合,但疫苗成品ED_(50)和其他各项检测指标均无明显变化,动物异常毒性合格。甲醛处理和未处理疫苗成品的稳定性考察结果相同。结论重组乙型肝炎疫苗生产工艺中甲醛处理步骤对疫苗成品检测指标及稳定性无影响,可考虑取消,从而提高乙肝疫苗的质量和安全性。     

汉逊酵母高密度发酵表达乙型肝炎表面抗原的甲醇流加控制策略

目的考察不同甲醇流加策略对汉逊酵母(Hansenula polymorpha)高密度发酵表达重组乙型肝炎表面抗原的影响。方法在细胞生长阶段采用DO/pH在线测量的控制方法,使酵母细胞密度达到一个较高水平,诱导期比较DO-Stat/pH-Stat法和离线检测甲醇两种控制流加甲醇的方法,同时也比较用甘油和甲醇双碳源间断流加法与单纯流加甲醇法对目的蛋白表达的影响。结果诱导期用DO-Stat和pH-Stat法不能有效地提高乙肝表面抗原表达量,而离线检测甲醇的控制方法,在诱导阶段可将甲醇浓度控制在0~5g/L的范围,乙肝表面抗原表达量比DO-Stat/pH-Stat法提高了20%。甲醇氧化酶(MOX)酶活性的变化与乙肝表面抗原表达量变化存在对应关系,交替加入甘油和甲醇双碳源刺激,可以使乙肝表面抗原表达量达到395mg/L。结论已筛选出优化工艺配置,并建立了切实可行的规模化生产工艺。     

Tollip体外转染HepG2215细胞对HBsAg和HBeAg分泌的影响及其机制

目的探讨Tollip转染人肝癌细胞系HepG2215细胞对HBsAg和HBeAg分泌的影响及其机制,为乙型肝炎的治疗寻找新的靶点。方法含HA标签的重组表达质粒pCMV-HA-Tollip经EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定后,采用脂质体LipofectamineTM2000转染HepG2215细胞,共设4个转染组:脂质体转染对照组(15μl脂质体)、空质粒转染对照组(6μg空质粒、15μl脂质体)、空质粒重组质粒共转染组(3μg空质粒、3μg pCMV-HA-Tollip、15μl脂质体)及重组质粒转染组(6μgpCMV-HA-Tollip、15μl脂质体),转染48 h后,收集细胞,经Western blot检测AKT、p-AKT、NF-κB以及HA标签蛋白的表达;收集上清,ELISA法检测HBsAg和HBeAg的水平。结果重组质粒pCMV-HA-Tollip经双酶切鉴定构建正确。空质粒重组质粒共转染组和重组质粒转染组均有HA标签蛋白的表达,而脂质体转染对照组和空质粒转染对照组无HA标签蛋白表达;与空质粒转染对照组比较,空质粒重组质粒共转染组和重组质粒转染组中NF-κB和p-AKT蛋白的表达明显降低(P<0.01),而AKT蛋白的表达无明显变化(P>0.05);空质粒重组质粒共转染组和重组质粒转染组细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量明显低于空质粒转染对照组(P<0.01),对HBsAg的抑制率分别为24%和41%,对HBeAg的抑制率分别为13%和31%。结论 pCMV-HA-Tollip重组质粒在HepG2215细胞中能有效抑制HBsAg和HBeAg的分泌,其机制可能与抑制AKT的磷酸化和下调NF-κB的表达有关。     

表达乙型肝炎表面抗原的重组CHO细胞无血清培养基的优化及生物反应器培养

目的优化表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的重组CHO细胞的无血清培养基,并进行生物反应器高密度培养。方法通过对现有重组CHO细胞无血清培养基SFMB的氨基酸、蛋白类激素、蛋白水解物等的优化,建立针对表达HBsAg的重组CHO细胞无血清低蛋白(<10mg/L)培养基SFMC。并利用此培养基在生物反应器中分批、流加、灌注悬浮培养重组CHO细胞,通过最大细胞密度和HBsAg产率评价不同的培养模式。结果 SFMC与原培养基SFMB相比,使重组CHO细胞的最大细胞密度提高了20%,HBsAg表达量提高了25%。在生物反应器培养过程中,灌注培养的重组CHO细胞表达的HBsAg产率为0.70mg/(L·d),较分批和流加培养的0.30mg/(L·d)提高了约133%。结论通过无血清培养基优化及生物反应器高密度培养,可显著提高重组CHO细胞表达HBsAg的效率。     

抗乙型肝炎病毒表面抗原的IgG全抗体表达载体的构建

目的构建抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的IgG全抗体杆状病毒表达载体。方法用PCR方法扩增抗HBsAg抗体Fab片段的轻链(L)及重链Fd段(VH+CH1)基因片段,将杆状病毒载体pAC-k-Fc与L基因连接,重组为过渡表达载体pAC-k-L-Fc,再与Fd基因连接,构建重组表达载体pAC-HBs-Fc,并进行酶切鉴定及DNA测序分析。确定正确后,转染昆虫细胞sf9,用免疫荧光检测IgG的表达。结果PCR扩增的片段约650bp,与预期值一致。载体pAC-k-L-Fc和pAC-HBs-Fc的酶切片段和DNA序列与预期结果一致。转染sf9细胞呈阳性荧光反应,未转染细胞呈阴性荧光反应。结论已成功构建表达载体pAC-HBs-Fc,为表达抗人HBsAg的IgG全抗体奠定了基础。     

HBsAg缺失型乙型肝炎病毒复制细胞模型的建立及其对乙型肝炎病毒复制的影响

目的体外构建HBsAg缺失型乙型肝炎病毒(HBV)复制细胞模型,并探讨HBsAg对HBV复制的影响。方法定点突变pch9质粒上HBV 1.1倍体基因S蛋白表达区,构建HBV1.1倍体HBsAg突变质粒,并进行测序鉴定;将鉴定正确的突变质粒瞬时转染HepG2细胞,设未突变pch9质粒转染细胞作为对照,采用ELISA法检测转染72 h的细胞培养上清中HBsAg的表达;Southern blot及Real-time PCR法检测转染72 h的细胞内HBV DNA的复制水平。结果定点突变质粒经测序证实构建正确;突变质粒转染72 h的细胞培养上清中HBsAg A450值为(0.06±0.003),表达呈阴性,对照细胞A450值为(1.82±0.010),表达呈阳性,转染突变质粒72 h的细胞内HBV DNA条带浓度明显高于转染未突变质粒的细胞;转染突变质粒的细胞内HBV DNA绝对拷贝数分别为9.33×106、5.26×106,约为转染未突变质粒(6.91×105)的7.6～13.5倍。结论已成功构建了HBsAg缺失型HBV复制细胞模型,为HBV DNA复制及相关研究提供了实验依据;推测HBsAg是HBV DNA形成的自限性因素,能够负调控HBVDNA复制。