多重PCR法对乳制品中3种致病菌的同时快速检测

通过调整混合培养基的配比摸索乳制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的快速共增菌条件,并选择稳定高效的细菌基因组DNA提取方法,然后根据三种目标致病菌的保守基因分别设计多重PCR引物,对致病菌进行多重PCR检测.结果表明,方法具有良好的针对目标致病菌的特异性,检测限可达102mL1.且反应体系各组分间未见交叉干扰.对人工污染的乳品盲样检测验证了方法的实用性.     

3种食源性致病菌多重PCR检测体系的建立

目的:探究用PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)及志贺氏菌(Shigella spp.)的检测灵敏度,建立快速检测3种食源性致病菌的多重PCR方法。方法:分别依据金黄色葡萄球菌的fem A、沙门氏菌的hil A基因及志贺氏菌的ipa H基因设计3对特异性引物,对3对引物进行多重PCR反应体系构建与优化。结果:建立的多重PCR方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷的优点。结论:研究结果为上述3种食源性致病菌快速检测试剂盒的研发及在食品安全检测工作中的应用提供了重要技术保障。     

南美白对虾中四种病原菌的多重PCR检测

根据沙门氏菌的侵染上皮细胞表面蛋白基因(invA)、单增李斯特菌的侵入关联蛋白基因(iap)、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)和副溶血性弧菌的耐热直接溶血素基因(tdh)分别设计4对特异性引物,并以细菌16S rRNA基因的部分保守序列为内标,通过对退火温度、引物浓度等反应参数的调整和优化,建立的多重PCR方法为10×PCR buffer 2.0μL(含Mg2+)、dNTP 200μmol/L、DNA模板1μL、Taq DNA聚合酶2.5U,引物浓度分别为16S rRNA 200nmol/L、tdh 250nmol/L、nuc 300nmol/L、iap 350nmol/L、invA 250nmol/L,加无菌水至总体积为20μL;反应条件：94℃预变性4min、94℃变性30s、57℃退火40s、72℃延伸1min、72℃延伸10min,反应共进行30个循环。为检验该方法的可行性,进一步对人工接种上述4种病原菌的南美白对虾进行多重PCR检测。结果表明：对污染样品直接提取DNA和预增菌后提取DNA再进行多重PCR检测,均能有效扩增出各个目的片段;但预增菌处理后可使检测限明显降低,进而大大提高检测的灵敏度。本多重PCR方法可作为食品包括水产品中病原微生物的快速、灵敏和高效的检测方法。     

三重PCR（聚合酶链式反应）检测鸡肉中常见病原菌的研究

建立鸡肉中常见3种致病菌即小肠耶尔森氏菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的多重PCR(聚合酶链式反应)检测方法。方法:分别选择小肠耶尔森氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7基因组中高特异性的ail基因、inv A基因和ECs3032,设计并筛选具有高特异性的引物用于PCR(聚合酶链式反应)扩增。建立一种此3种致病菌的三重PCR检测方法,并通过人工污染实验对该法进行验证。结果:3对引物能特异地扩增出251、347、469 bp的目的条带;灵敏度:对这3种致病菌的单菌培养物检测灵敏度均为101CFU/m L。同时检测3种菌的灵敏度为103 CFU/m L。结论:该检测方法高效、精确、特异性强、灵敏度高,6 h~8 h内可同时快速检测多种致病菌,节省了大量时间。在实际检测中具有很好的实用价值和开发前景,可在食品检测和临床检验等领域大力推广。     

食品中3种致病菌的Taqman多重荧光定量PCR检测

利用实时荧光定量PCR(RTi-PCR)技术探索病原微生物的快速高通量检测方法已是食品微生物学的研究热点之一。首先,通过调整混合培养基的配比摸索食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的快速共增菌条件,并选择稳定高效的细菌基因组DNA提取方法,然后根据3种目标致病菌的保守基因分别设计RTi-PCR引物和双标记Taqman探针,分别使用FAM、TAMRA及CY5作为报告基团,对致病菌进行多重RTi-PCR检测,并设计、构建了阳性内参用于检测反应体系。结果表明,方法针对42种已知目标菌株和21种已知菌株组合特异性良好,检测限可达101 cfu/PCR反应,且反应体系各组分间未见交叉干扰。阳性内参Ct值保持稳定,有效地保证了检测的可靠性。对人工污染的食品盲样检测验证了方法的实用性。总之,建立了一种食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌同时快速检测的多重RTi-PCR方法,为食源性致病菌的检测提供了新的方法学依据。     

PCR法快速检测三种食源性致病菌的研究

目的 探讨用PCR方法快速检测食品中沙门氏菌(Salmonella spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和志贺氏菌(Shigella spp.)的实用性。方法 采用能力验证实验和超市样品检测实验对PCR方法与传统检测方法进行比较。结果 与传统检测方法相比, PCR方法检测以上三种食源性致病菌的结果准确率达到99%以上, 假阳性率低于1%, 假阴性率为0。结论 PCR检测方法具有检测周期短等优点, 可以在当前的食品安全检测工作中应用推广。     

二重PCR法快速检测3种食源性致病菌

目的建立快速检测食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)及志贺氏菌属(Shigella spp.)的二重PCR方法。方法分别针对金黄色葡萄球菌.femA和nuc、沙门氏菌属invA和hilA及志贺氏菌属ipaB和ipaH设计6对特异性引物,检测每对引物的特异性及灵敏度,组合优化各自二重PCR反应体系。结果初步建立了针对这3类致病菌的二重PCR检测方法,整个检测过程不超过18 h,检测灵敏度均可达10 pg DNA/reaction。结论所建立的针对3类致病菌的二重PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和方便高效等优点,具有良好的市场应用前景。     

4种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法研究

为快速检测蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和沙门氏菌4种食源性致病菌,建立4重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的检测方法。针对菌株的特异性基因设计引物,选择退火温度相近,扩增条带区间不同的引物为多重聚合酶链式反应引物组,并对多重PCR的引物浓度、退火温度进行优化,确定扩增条件。结果表明,在54℃的退火温度下,4种菌可扩增长度为246、166、65、107 bp的清晰片段,其检测灵敏度为蜡样芽孢杆菌2×101CFU/mL,金黄色葡萄球菌可达1.3×102 CFU/mL,志贺氏菌可达1.3×102 CFU/mL,沙门氏菌可达1.4×102 CFU/mL。     

多重荧光定量PCR检测食品污染菌

目的:建立食品中多种细菌同时检测的方法。方法:以肠杆菌科细菌16S RNA、金黄色葡萄球菌FemB基因以及和沙门氏菌的invA基因为目标,设计相应的引物和Taqman探针;分别构建重组质粒作为模板,并建立3种菌属各自荧光定量PCR检测方法和多重荧光PCR体系,考察各方法的灵敏性,并比较多重荧光PCR与单重体系下检测结果的一致性。结果:多重荧光PCR体系与单重体系具有很好的一致性。结论:多重荧光定量PCR能够实现在同一反应体系下同时对食品中多种污染菌进行准确快速的检测。     

致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌分离鉴定及三重PCR检测方法的建立

为鉴定导致患病鲫鱼肛门红肿、腹部有出血点症状的病原菌,并建立一种快速检测该病原菌的方法.本研究从患病鲫鱼中分离了病原菌,采用形态学、理化特性分析及16SrDNA序列分析方法鉴定菌株.采用PCR扩增法检测该菌毒力基因,琼脂纸片扩散法检测该菌株的耐药性,致病性能验证试验检测其致病性.针对该菌ail基因、inv基因和intB...     

食品中3种致病菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

建立用多重聚合酶链式反应(Multiplex polymerase chain reaction,mPCR)同时检测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的方法。以沙门氏菌的gyrB基因、单核细胞增生性李斯特菌的gyrB基因、金黄色葡萄球菌的coa基因作为目的基因,分别设计3对引物,通过优化反应体系,建立3种致病菌的多重PCR检测体系。采用单重PCR检测时,灵敏度可达0.423ng/mL(沙门氏菌)、2.5ng/mL(金黄色葡萄球菌)和0.36ng/mL(单核细胞增生性李斯特菌);而采用三重PCR检测时,灵敏度较单重PCR有所下降,分别为2.43ng/mL(沙门氏菌)、2.5ng/mL(金黄色葡萄球菌)、3.6ng/mL(单核细胞增生性李斯特菌)。初步建立能同时、快速、灵敏地检测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的三重PCR方法。     

食品中3种致病菌多重PCR检测体系的建立及初步应用

目的:建立同步速测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法:利用基因组比对法寻找3种致病菌的特异性序列——沙门氏菌的invA基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因和单增李斯特菌的prs基因,运用Primer Premier 5.0分别设计3对片段大小不同的特异性引物;通过优化反应体系,建立3种致病菌的多重PCR检测体系。结果:建立的多重PCR方法灵敏度测试结果分别为7.6、3.8、5.1pg/μL,在此灵敏度下可以扩增出全部特异性引物条带,验证性实验结果出现相应的目的条带且未发生交叉影响。结论:初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中沙门菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的三重PCR方法。     

3种致病菌多重real-time PCR检测方法的建立及其在散装即食肉制品中的应用

建立一种同时快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的三重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法.以沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌Sa442基因和蜡样芽孢杆菌Cereolysin AB基因为靶基因设计引物和TaqMan探针...     

5种食源性致病菌PCR检测方法的建立

目的建立食品中的沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌的PCR快速检测方法。方法以缓冲蛋白胨水为增菌培养基,采用直接提取法提取DNA并测定其核酸浓度。对PCR的退火温度、模板浓度进行优化,把5种目标菌分为两组进行检测分析,并进行特异性和灵敏度实验。结果 5种目标菌培养后均表现出良好的生长趋势。PCR扩增最佳退火温度为59℃, 5种目标菌的引物特异性好,方法的检测灵敏度高。沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌最低检出核酸浓度分别为0.0202、0.158、0.187、2.30和1.05μg/mL。结论该方法简便、快速、灵敏度高,能满足食品安全检测要求。     

速冻食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌多重PCR检测方法的建立与应用

为实现速冻食品中沙门氏菌(Salmonella spp.)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的多重聚合酶链式反应(PCR)检测,首先优化多重PCR扩增的反应条件,比较基因组DNA提取方法,结果表明：退火温度采用60℃、各引物浓度200nmol/L及扩增循环35次,本多重PCR检测技术可以有效地将沙门氏菌和金黄色葡萄球菌同时检出,检测特异性为100%。3种DNA提取方法中试剂盒法纯度最高,检出限分别是31、26DNA copies/reaction。经过在人工污染致病菌的速冻水饺中应用试验后,该多重PCR方法经过4h的增菌培养即可从速冻水饺中同时检测出起始菌落数低至100CFU/g的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。     

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

目的:建立同时快速检测沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法:根据沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因及肠出血性大肠杆菌O157∶H7的uidA基因设计3对引物,通过单因素实验、L9(34)正交实验优化反应体系,并对多重PCR扩增的敏感性进行分析。结果:3对引物能特异性扩增出495、620、252bp的目的片段;在最优多重PCR反应体系下,多重PCR检测3种致病菌的灵敏度达104CFU/mL;将该法应用于人工污染实验,可在5h内得到准确、稳定的检测结果。结论:该方法操作简单、检测特异性和灵敏度较高,能够实现对沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7 3种食源性致病菌的快速监控和诊断。      

散装食品中致病菌与卫生细菌指标检测技术研究

本研究旨在利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）快速检测并鉴定散装即食食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种食源性致病菌。通过对点样方式、前处理方式、不同培养基及培养时间等各项实验条件的优化筛选确定最佳方法,并考察其检测限和稳定性,同时用所建立的方法与多重PCR法、VITEK 2等生化鉴定法进行结果比对,比较三者鉴定结果的一致性,最后进行批量食品样本检测来探寻MALDI-TOF MS鉴定法在散装即食食品中的适用性。结果表明,三种目标菌同一批次及不同传代次数的鉴定得分均大于95%,变异系数均小于2%,所建立的方法重复性和稳定性良好,且检测限为10⁵ CFU/mL,MALDI-TOF MS菌株鉴定结果与多重PCR法、生化鉴定法结果高度一致,且比二者检测用时更短,更加特异高效;在点样方式上,相较于夹心法与混合干滴法,三种覆盖法点样平均鉴定得分更高,均为99.9%,其中1 µL+1 µL覆盖法点样可获得的平均峰数目更多,特征峰更复杂且强度更高;而在前处理方式上,甲酸乙腈法与其他两种菌体处理方法相比可获得更多的出峰量和更高的峰强度,平均鉴定得分均在98%以上,且与数据库中图谱匹配度更高。综上所述,MALDI-TOF MS法在致病菌鉴定方面不仅灵敏特异、准确快速,且操作简便、结果直观,作为国标法的有力补充,为食源性致病菌的分析鉴定与分型溯源提供了新思路。

     

多重PCR快速检测婴幼儿奶粉中的病原菌

为了建立同时检测婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的多重PCR方法,根据阪崎肠杆菌ompA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、蜡样芽孢杆菌hblA基因分别设计3对引物进行多重PCR扩增,并对反应条件进行优化。结果多重PCR扩增出长度为514、156、235bp的特异性目的条带。不增菌的情况下,多重PCR同时检测3种病原菌的灵敏度是103cfu/mL,3种病原菌在奶粉中的检出限是104cfu/g。建立的多重PCR反应准确、快速、高效,为同时检测婴幼儿奶粉中的阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌提供了新方法。     

乳制品常见致病菌选择性共增菌技术研究

以乳制品常见致病菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为目标菌,研究6种基础培养基、2种培养模式、20种培养基添加剂对增菌的影响,并以无显著抑制效应的添加剂对背景微生物进行了抑菌效应研究,建立了一种选择性富集目标菌的ESS培养基。使用该培养基37℃静止培养16 h,可实现目标菌的共增菌,对可能影响目标菌检测的乳制品中其他致病菌有一定抑制效果。