重组融合蛋白MBP-PAI的表达、纯化及酶活测定

为了解决亚油酸异构酶(Linoleic Acid Isomerase,PAI)在大肠杆菌中形成包涵体的问题,选择麦芽糖结合蛋白(Maltose-Binding Protein,MBP)标签和低温诱导表达系统pColdV,构建了大肠杆菌重组表达菌株E.coli BL21(pCold-Mpai),并对其诱导表达条件进行了优化。SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白MBP-PAI成功表达,重组菌的最佳诱导表达条件为:诱导温度15℃、IPTG添加量0.1 mmol/L、诱导时间12 h,在该诱导条件下,与未融合MBP的PAI相比,MBP-PAI的可溶性表达量为后者的18倍、酶活为后者的1.5倍。经过MBPTrap HP亲和层析柱纯化后,MBP-PAI纯蛋白质的比酶活为1.58 U/mg,能够转化亚油酸形成反10,顺12-共轭亚油酸。     

一种SUMO-Heparinase Ⅰ融合酶的可溶性表达与纯化

克隆自肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum)的肝素酶Ⅰ(Heparinase Ⅰ,EC4.2.2.7)广泛应用于低相对分子质量肝素(LMWH,low molecular weight heparin)制备研究。然而,该酶在大肠杆菌表达体系中易形成包涵体,限制了其大量应用。将可溶性配体SUMO(small ubiquitin-like modifier,小泛素类似修饰蛋白质)与C端带有6×His标签的肝素酶基因片段N-端融合表达,菌体总蛋白质和可溶性蛋白质SDS-PAGE电泳表明,N端融合SUMO的肝素酶Ⅰ可溶性表达比率显著提高;通过镍-亲和柱层析得到均一纯化的融合肝素酶Ⅰ,融合酶酶学性质表明该融合酶可直接应用于肝素降解而无需切除SUMO标签,为肝素酶Ⅰ的广泛应用提供了良好的技术基础。     

痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶在毕赤酵母中的异源表达 及其静息细胞催化合成共轭亚油酸

来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的亚油酸异构酶（PAI）是一种能够通过单酶催化,生成共轭亚油酸（t10,c12-CLA）的亚油酸异构酶。为实现PAI的高效表达,以pPink为表达载体,毕赤酵母（PichiaPinkTM Strain2）为宿主菌,构建毕赤酵母重组菌株（Pichia-pPink-His-opai）,实现了PAI在毕赤酵母中的异源表达。对毕赤酵母重组菌进行初步筛选获得蛋白表达量最高的转化子,通过单因素实验优化毕赤酵母重组菌的诱导条件。毕赤酵母重组菌最佳诱导条件为：诱导时间24 h,诱导剂甲醇体积分数2%。在最佳诱导条件下,将毕赤酵母重组菌制成静息细胞催化剂催化合成t10,c12-CLA。在28 ℃、200 r/min、亚油酸质量浓度4 g/L、反应时间6 h条件下,t10,c12-CLA产量为2.12 g/L,转化率可达53%。     

栓菌漆酶的异源表达及重组酶碳端和氮端组氨酸标签修饰对酶学特性的影响

以来源Trametes sp.C30 的LAC3漆酶基因为研究对象,通过引物设计进行突变,在其C端和N端进行延长,分别引入6 个组氨酸标签,并异源表达于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中,将获得的重组酶进行比较发现漆酶末端氨基酸序列的改变对酶学性质的影响较大。C端引入组氨酸标签的重组酶的表达量不受影响,但是在N末端引入组氨酸标签的重组酶表达量只有LAC3的一半。添加组氨酸标签的融合蛋白对ABTS和SGZ两种底物的亲和力得到增强。而在酸碱稳定性耐受方面,与LAC3相比,N末端氨基酸的改变使其在酸碱稳定性方面得到了增强,中碱性条件下仍能保持较佳活性。C端和N端可塑性的研究对于漆酶新性状的获得具有重要意义。     

双歧杆菌源亚油酸异构酶的原核表达及功能分析

来源于短双歧杆菌CCFM683的亚油酸异构酶(Bifidobacterium breve isomerase, BBI)是目前唯一已知的乳酸菌源单酶转化亚油酸生成共轭亚油酸c9,t11-CLA单体的亚油酸异构酶。该文以pET-28a(+)为表达载体，构建组氨酸标签分别位于C端和N端的重组载体pET-28a(+)-bbi-His和pET-28a(+)-His-bbi,分别实现其在BL21(DE3)、BL21(DE3) pLysS和Rosetta(DE3) 3种类型的大肠杆菌(Escherichia coli)宿主中的异源表达和条件优化。结果表明表达BBI的最优重组菌为E.coli Rosetta/pET-28a(+)-bbi-His,最佳诱导条件为以1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导8 h,且当用BBI粗酶转化脂肪酸时，相较于亚油酸和γ-亚麻酸，BBI更偏好转化α-亚麻酸。     

定向进化植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌高产共轭亚油酸

为获得高产共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）的菌株，对亚油酸异构酶系植物乳杆菌的肌球蛋白交叉反应抗原（myosin-cross-reactive antigen，MCRA）基因mcra和痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶基因lai-p进行克隆，克隆成功后连接到骨架质粒pCold-SUMO上构建两种含mcra基因和lai-p基因的大肠杆菌重组菌株，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷低温诱导阳性重组菌蛋白表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证得到目的蛋白表达条带，说明两种基因表达成功。采用易错聚合酶链式反应定向进化mcra基因和lai-p基因，构建重组菌突变体库，利用流式细胞术分选获得吸光度提高和CLA产量提高的重组菌株，其中pCold-ycmcra-gfp重组菌243 株，吸光度最高的为155号菌1.050 6±0.000 4，提高了5.02 倍；pCold-yclai-p-gfp重组菌156 株，产量最高的为39号菌（11.62±0.003 6）μg/mL，提高了2.99 倍。本研究为后期深入了解突变菌株CLA产量提高的原因，并获得两种亚油酸异构酶的产酶机制奠定了一定基础。     

氮源对解脂耶氏酵母合成共轭亚油酸的影响

为了提高解脂耶氏酵母重组菌株合成反-10,顺-12-共轭亚油酸的产量,以YNBDSa为发酵培养基进行摇瓶发酵,研究氮限制策略及氮源种类对菌株合成脂肪酶Lip2、亚油酸异构酶PAI及反-10,顺-12-共轭亚油酸产量的影响。结果表明:高氮培养基更利于菌体生长以及产物的合成,反-10,顺-12-共轭亚油酸产量达到4.3 g/L,是低氮培养基对应结果的8.6倍;采用有机氮为氮源时,Lip2酶活及PAI表达量显著高于无机氮的结果,反-10,顺-12-共轭亚油酸产量最高达到4.6 g/L,是无机氮结果的46倍。     

一种SUMO-Heparinase I融合酶的可溶性表达与纯化

克隆自肝素黄杆菌（Flavobacteriumheparinum）的肝素酶I（Heparinase I,EC4.2.2.7）广泛应用于低相对分子质量肝素（LMWH,low molecular weight heparin）制备研究。然而,该酶在大肠杆菌表达体系中易形成包涵体,限制了其大量应用。将可溶性配体SUMO（small ubiquitin?鄄like modifier,小泛素类似修饰蛋白质）与C端带有6×His标签的肝素酶基因片段N?鄄端融合表达,菌体总蛋白质和可溶性蛋白质SDS?鄄PAGE电泳表明,N端融合SUMO的肝素酶I可溶性表达比率显著提高;通过镍?鄄亲和柱层析得到均一纯化的融合肝素酶I,融合酶酶学性质表明该融合酶可直接应用于肝素降解而无需切除SUMO标签,为肝素酶I的广泛应用提供了良好的技术基础。     

藤黄微球菌过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的重组与表达

目的应用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达藤黄微球菌过氧化氢酶(catalase,CAT)。方法从藤黄微球菌DNA中获得CAT编码基因,并应用pProEx-HTa质粒构建融合表达载体并表达和检测活性。结果通过融合表达获得可溶性带6×His标签重组蛋白,该蛋白经过Ni-NTA纯化后可获得活性物质。结论从大肠杆菌表达体系中表达了具有生物活性的CAT。     

磷脂酶C对大肠杆菌细胞膜通透性的影响

本文在大肠杆菌(E.coli BL21 DE3)中分别克隆表达了产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)来源的磷脂酶C(PLC)基因,并系统研究了内源表达的重组PLC对大肠杆菌BL21(DE3)内外膜通透性的影响。结果表明内源表达的产气荚膜梭菌和单核细胞增生性李斯特菌重组PLC对宿主菌内膜通透性影响较大,但对宿主菌外膜通透性的影响相对较弱。此外,本文对两种不同来源重组表达的磷脂酶C蛋白进行了分离纯化,分析了外源添加重组磷脂酶C对大肠杆菌BL21(DE3)细胞膜通透性的影响。结果表明外源PLC对大肠杆菌外膜通透性影响较大,而对内膜通透性影响相对较小。综上所述,产气荚膜梭菌和单核细胞增生性李斯特菌来源的磷脂酶C可以改善大肠杆菌细胞膜的通透性,为进一步提高大肠杆菌工程菌株蛋白异源表达提供新的思路。     

金黄色葡萄球菌M型肠毒素原核表达、纯化、鉴定及溶液构象分析

葡萄球菌肠毒素M是由金黄色葡萄球菌νSa基因岛编码的分泌型超抗原。本研究将截去N端信号肽的金黄色葡萄球菌M型肠毒素(staphylococcal?enterotoxin?M,SEM)蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体p ET-28a(+),构建重组表达质粒p ET-28a(+)-ΔNspsem;随后转化感受态E.coli?Rosetta(DE3)并探讨融合蛋白最佳表达条件;利用Ni2+-Sepharose?4?Fast?Flow亲合层析纯化出His-ΔNsp SEM融合蛋白;经质谱鉴定,纯化的融合蛋白对SEM的氨基酸覆盖率达96.3%;凝血酶切除6×His标签肽后,圆二色谱分析表明ΔNsp SEM重组蛋白富含β-折叠(35%)和β-转角(21%)以及较少α-螺旋(16%)等二级结构;荧光发射谱揭示ΔNsp SEM在278?nm和295?nm波长处激发时具有相同的Trp发射峰(341?nm);十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分析表明ΔNsp SEM重组蛋白表现出较高的热稳定性。研究结果表明重组蛋白SEM表达成功,纯化的ΔNsp SEM重组蛋白溶液构象紧密并具有接近天然状态的结构,这为深入研究SEM蛋白的结构与功能提供理论支持。     

瘤胃中干酪乳杆菌的亚油酸异构酶基因的克隆与表达

以从黄牛瘤胃中分离到的一株具有将亚油酸转化为c9,t11-共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Fx为出发菌株,提取其基因组DNA,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增得到1 700 bp大小的亚油酸异构酶(linoleic acid isomerase,LAI)基因片段,将该基因片段纯化后进行TA克隆,得到重组质粒p UCm-T-LAI,将重组质粒p UCm-T-LAI和表达质粒p ET-Dsb A同时进行双酶切,连接得到重组表达载体p ET-Dsb A-LAI,经PCR鉴定和酶切后,将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中,得到具有LAI活性的重组菌株,能将亚油酸转化为c9,t11-CLA,表明从Lactobacillus casei Fx成功克隆LAI,该研究将有助于深入了解不同瘤胃细菌特异性合成不同CLA异构体的LAI基因差异。     

噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达

噬夏孢欧文氏菌基因crtE编码GGPP合成酶。通过PCR扩增获得crtE基因,克隆进表达载体,构建表达质粒pET-15bcrtE。重组质粒转化E.coli BL21(DE3),构建工程菌;重组GGPP合成酶在大肠杆菌中实现了高效表达,表达量占菌体总蛋白的42%。重组蛋白以包含体形式存在,包含体经洗涤、尿素溶解、复性并经镍离子亲和层析树脂纯化,得到了电泳纯的重组噬夏孢欧文氏菌GGPP合成酶,带有His-tag的该蛋白分子量为34kDa,pI值为6.3。     

人乙醛脱氢酶2与NusA的融合表达

通过将乙醛脱氢酶2（acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2）与NusA-tag融合表达,以获得能够在大肠杆菌中可溶性表达并且具有较好活性的重组蛋白。首先,根据Aldh2的基因序列设计引物,引入EcoRI和XhoI的酶切位点,聚合酶链式反应扩增出Aldh2基因片段,连接到pMD19-T-simple载体,并转化到大肠杆菌DH5α菌株。测序正确后,双酶切处理,将Aldh2基因片段克隆到表达载体pET44b（＋）上NusA-tag下游的EcoRI和XhoI酶切位点之间,得到pET44b（＋）-NusA-Aldh2重组载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导,表达的融合蛋白具有良好的溶解性,主要存在于上清液中。融合蛋白的最优表达条件为IPTG浓度0.25 mmol/L、诱导温度37 ℃、诱导时间3 h。重组蛋白的最适反应温度为37 ℃,在pH 7.0时达到最好的催化效果。不同金属离子如Ca2＋、K＋、Na＋、Mg2＋、Mn2＋都对酶有激活作用,且Mg2＋效果最好,最佳的酶活性为1.64 U/mL。而野生型ALDH2在大肠杆菌中表达时完全以无活性的包涵体形式存在,复性后得到的酶活性为1.43 U/mL。本研究通过引入NusA进行融合表达,实现了ALDH2在大肠杆菌中的可溶性表达,且重组蛋白的活性优于包涵体复性蛋白。这些结果表明利用NusA进行融合表达是制备重组ALDH2的一个良好方法。     

Survival to different acid challenges and outer membrane protein profiles of pathogenic Escherichia coli strains isolated from pozol, a Mexican typical maize fermented food

In this study, the acid resistance and the changes in outer membrane protein (Omps) profiles of Escherichia coli strains isolated from pozol, an acid-fermented maize beverage consumed in Southeastern Mexico, were determined. Results showed that adaptation to acid by these E. coli strains significantly enhances their survival in acid conditions. Changes in Omp profiles were found in non-adapted acid challenged cells compared with non-challenged cells that had not been adapted to acid. Challenged adapted cells showed no significant changes in these profiles when compared with the acid adapted non-challenged strains. N-terminal sequences of some of the Omps were determined. The intensity of the main porins OmpC and OmpA was lower in the acid challenged strains, than in the non-challenged ones. The OmpF porin was identified in non-challenged K12 strain, but did not appear in adapted or non-adapted pozol strains nor in E. coli O157:H7. A protein band with an approximate molecular mass of 22 kDa corresponds to OmpW and its expression decreased in pozol strains challenged with HCl and lactic acid. OmpX was one of the main proteins expressed when strains were acid challenged with organic acids. Seventy out of seventy-three E. coli strains isolated from pozol in a previous work [Sainz, T., Wacher, C., Espinoza, J., Centurion, D., Navarro, A., Molina, J., Cravioto, A., Eslava, C., 2001. Survival and characterization of Escherichia coli strains in a typical Mexican acid-fermented food. International Journal of Food Microbiology 71, 169-176] carry this gene and belong to a reported pathogenic class of E. coli strains, or have virulence factors or survived at pH values less than 4.8. We suggest this protein could be involved in survival to stress conditions.     

猪肉12-脂肪氧合酶催化结构域的表达、纯化及其酶学性质分析

研究脂肪氧合酶（lipoxygenase,LOX）在猪肉贮藏、加工过程中对脂肪氧化及风味形成的作用机制。通过序列分析和聚合酶链式反应扩增获得了猪肉12-脂肪氧合酶催化结构域（12-lipoxygenase catalytic domain,12-LOXcd）的编码基因,采用大肠杆菌表达系统,经镍柱亲和层析和Superdex G200凝胶过滤层析纯化得到12-LOXcd蛋白,并研究其酶学性质。结果表明,构建的原核表达载体pMBP-12-LOXcd在大肠杆菌中成功可溶性表达了猪肉12-LOXcd,该重组蛋白经纯化可达电泳纯。12-LOXcd以亚油酸为底物的比活力为2 826.7 U/mg,最适pH值为6.0,最适作用温度为30 ℃。亚油酸Km为0.40 mmol/L,亚麻酸Km为0.55 mmol/L,花生四烯酸Km为4.15 mmol/L,表明最适底物为亚油酸。与大豆LOX相比,该酶在较高NaCl质量分数（9%）时仍保持活性稳定;对热较不稳定,在60 ℃条件下失活,但优于大豆LOX的热稳定性;此外,12-LOXcd的pH值稳定性也优于大豆LOX,在碱性条件下仍能保留部分活力。     

密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶基因xylA的克隆及其表达条件的优化

为克隆、表达密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶(GI)基因xylA,并对其诱导表达条件进行初步优化。采用Slowdown PCR方法克隆得到密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)CICIM B0118(A)的葡萄糖异构酶基因xylA,构建pET-28a(+)-xylA 表达载体,并转化至E. coli BL21 (DE3),经异丙基-β -D- 硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并对其表达产物进行SDS-PAGE 电泳。结果表明,融合蛋白分子质量约为45kD。在诱导时间9h、0.6mmol/L IPTG、30℃和OD600nm 值为0.8 的最适培养条件下,酶比活力最高达到62.42U/mL。