二硫键对提高木聚糖酶AoXyn11A热稳定性的作用

为提高米曲霉11家族中温木聚糖酶Ao Xyn11A的热稳定性,将Ao Xyn11A与源于Thermomyces lanuginosus的耐热木聚糖酶Xyn A进行三维结构比对分析,发现Xyn A的α-螺旋与β9-折叠之间存在一个二硫键;基于分子动力学模拟预测结果,利用定点突变技术在Ao Xyn11A的相应位置引入二硫键(Cys108-Cys152),获得突变酶Ao Xyn11AT;分别将Ao Xyn11A及其突变酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经纯化,获得重组Ao Xyn11A和Ao Xyn11AT,并分析比较温度对其酶活性的影响。结果显示,重组Ao Xyn11AT的最适温度为60℃,比重组Ao Xyn11A提高了5℃;其在50℃下的半衰期t1/250为71 min,较重组Ao Xyn11A(t1/250=25 min)提高了近2倍。研究表明二硫键对提高Ao Xyn11A的热稳定性有重要作用。     

V1C定点突变木聚糖酶XynZF-2对酶热稳定性的影响

对来源于黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S的中温木聚糖酶Xyn ZF-2进行热稳定性改造,定点突变v1c,构建重组突变酶Xyn ZF-2V1C。重组原酶Xyn ZF-2与突变酶Xyn ZF-2V1C基因分别在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并进行酶学性质分析。结果发现,突变酶Xyn ZF-2V1C最适温度为50℃,相比原酶Xyn ZF-2最适温度提高了10℃;在45℃条件下的半衰期t45℃1/2,突变酶Xyn ZF-2V1C相对于原酶Xyn ZF-2提高了10 min;原酶Xyn ZF-2与突变酶Xyn ZF-2V1C最适p H均为5.0,p H稳定范围均为5.0~9.0,基本没有变化;原酶Xyn ZF-2和突变酶Xyn ZF-2V1C的Km分别9.96 mg/m L和12.4 mg/m L,Vmax分别为74.63 U/mg和90.91 U/mg。     

N-端二硫键及芳香族氨基酸对木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

为提高GH11家族中温木聚糖酶Xyn ZF-2的热稳定性,将其N-端替换成GH11家族的耐热性木聚糖酶Ev Xyn11的相应序列,并在该段序列引入芳香族氨基酸残基(P9Y、H14F),构建杂合木聚糖酶基因xyn EV-34,将木聚糖酶基因xyn ZF-2和xyn EV-34分别在E.coli BL21中表达,并分析温度和p H对酶活性的影响。结果表明,杂合木聚糖酶Xyn EV-34的最适温度为48℃,相比原酶Xyn ZF-2提高了8℃。在40℃保温1 h,原酶Xyn ZF-2残余酶活性下降到44.36%,而突变酶Xyn34残余酶活性为77.96%。在45℃,突变酶Xyn EV-34的半衰期t1/245℃为23 min,较重组酶Xyn ZF-2(t1/245℃=7 min)提高了16 min。同时,两种酶的最适p H均为5.0,但p H稳定性由原来的4.4~9.0扩增到了3.0~9.0。由此表明,二硫键以及芳香族氨基酸的引入,对该酶的热稳定性以及p H稳定性都有明显改善。     

引入疏水性氨基酸对GH11家族木聚糖酶热稳定性的影响

生物信息学预测黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-2的催化活性中心位点,并在α-螺旋处引入疏水性氨基酸以提高木聚糖酶Xyn ZF-2的热稳定性。通过定点突变活性位点E103D、E194D,构建突变基因xyn ED。同时,将α-螺旋处氨基酸Val125、Lys178和Gly180分别突变为疏水性氨基酸Ala、Met和Ala,构建突变基因xyn MA。突变基因xyn ED和xyn MA在大肠杆菌BL21中表达发现,突变酶Xyn ED酶活性为原酶Xyn ZF-2的0.17%;突变酶Xyn MA最适温度由原来的40℃提高到了48℃;在40℃条件下保温1 h,突变酶Xyn MA酶活性仍高达74.71%（原酶Xyn ZF-2为44.36%）;突变酶Xyn MA的半衰期t45℃1/2从原来的7 min提高到了19 min。因此,Glu103和Glu194为木聚糖酶Xyn ZF-2的催化活性中心位点,且在木聚糖酶Xyn ZF-2α-螺旋处引入疏水性氨基酸能大大提高其热稳定性。      

S179C突变提高宇佐美曲霉木聚糖酶(XynII)热稳定性的研究

宇佐美曲霉木聚糖酶（XynⅡ）是G／11族高比活木聚糖酶的一种,通过S179C定点突变,发现酶最适反应温度由原来的50℃提高到52℃;50℃热处理,半衰期由原酶的23min延长到突变后酶的70min,热稳定性提高到原来的3倍;最适反应pH无变化。     

饱和突变改善米曲霉11家族木聚糖酶AEx11A的催化特性

为改善米曲霉(Aspergillus oryzae)11家族木聚糖酶AEx11A的催化特性,作者采用全质粒PCR方法对AEx11A基因(AEx11A)中编码Thr~(98)、Asn~(100)、Val~(124)、Pro~(129)和Ile~(132)的密码子实施饱和突变,构建饱和突变文库。以木聚糖酶的酶活性为指标,采用DNS法从文库中筛选出酶活性提高30%以上的转化子。对其中酶活性提高最明显的两个位点Thr~(98)和Val~(124)实施迭代饱和突变,筛选出最优突变子AEx11~(AT98D-V124Q),其纯化后的比活性及催化效率分别为AEx11A的3.04和2.74倍。此外,突变酶AEx11A~(V124T)的热稳定性较AEx11A有一定的提高,其余2个突变酶的温度特性与AEx11A差异不大。     

引入中性氨基酸对木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

通过对黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S木聚糖酶XynZF-2进行生物信息学分析,在N-端区域引入半胱氨酸,定点突变E27C,构建突变基因xyn-E27C,并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。酶学性质分析发现,突变酶Xyn-E27C的最适温度为45 ℃,与原酶XynZF-2相比提高了5 ℃。在40 ℃条件下,突变酶Xyn-E27C的半衰期t1/240 ℃为100 min,相比原酶XynZF-2（t1/245 ℃=55 min）提高了45 min。在45 ℃条件下,突变酶Xyn-E27C的半衰期t1/245 ℃为24 min,相比原酶XynZF-2（t1/245 ℃=7 min）提高了17 min;突变酶Xyn-E27C的最适pH值由5.0提高至5.5,而pH稳定范围均为5.0～9.0。因此,定点突变E27C对木聚糖酶XynZF-2的热稳定性以及最适pH值均有重要影响。     

米曲霉RIBl28耐酸性木聚糖酶的研究

通过RBB-Xylan筛选平板和固体培养方法获得了产木聚糖酶菌株米曲霉(Aspergillus     

Loop结构引入半胱氨酸对木聚糖酶XynASP热稳定性的影响

为了探究Loop结构引入半胱氨酸对GH11家族木聚糖酶热稳定性的影响,以溶糖曲霉（Aspergillus saccharolyticus）JOP 1030-1木聚糖酶XynASP Loop结构为研究对象,通过定点突变技术,将第95位点天冬酰胺（Asn）突变成半胱氨酸（Cys）,获得突变体XynN95C,并在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中诱导表达。酶学性质分析结果表明,突变体XynN95C最适温度为50 ℃,酶活性半衰期t1/240 ℃为38 min,相比野生型XynASP分别提高了5 ℃、18 min,最适pH从6.0降至5.0。另外,XynN95C的金属离子耐受性较强,经Fe3+处理1 h,相对酶活性为93.9%,较野生型（65.9%）明显提高。由此得出,在Loop结构引入半胱氨酸可有效提高木聚糖酶的热稳定性,这为GH11家族木聚糖酶的热稳定性改造又提供一新思路。     

人工设计二硫键增强谷氨酰胺转胺酶热稳定性

对S.hygroscopicus来源的谷氨酰胺转胺酶(microbial transglutaminase,MTG)进行分子改造,在MTG的N端区域引入二硫键,增强其热稳定性。通过序列比对与结构分析、运用Disulfide by Design软件,构建含有二硫键的突变体MTG(4-284)。在55℃下处理10 min,MTG(4-284)可以保持95%的酶活,而原始酶MTG仅剩15%的酶活。圆二色谱检测结果显示MTG和MTG(4-284)的T50分别为58和65℃。以上结果对MTG的分子水平的深入研究提供了基础,同时进一步满足其工业化应用的需求。     

木聚糖酶EvXyn11TS N端区域对其耐热性贡献的生物信息学分析

系统分析了11家族木聚糖酶EvXyn11~(TS)N端区域对其耐热性的影响。在GenBank数据库中借助BLAST服务器搜寻与EvXyn11~(TS)序列同源性大于55%且温度特性已知的30种木聚糖酶;运用ClustalW2程序和MEGA 5.1软件对31种木聚糖酶进行了多序列比对及进化树构建,从中选择了包含EvXyn11~(TS)在内的8种代表性耐热和中温酶;采用生物学程序软件分析了所选酶在N端的异同点。分析结果表明,EvXyn11~(TS)N端的耐热有利氨基酸含量、β-折叠股A1和氨基酸相互作用等对其耐热性有一定的贡献。     

基于残基-水作用网络的木聚糖酶耐热性研究

水在蛋白质折叠、相互作用、分子识别、动力学及耐热性方面发挥着重要作用。利用Voronoi算法识别出与耐热和常温木聚糖酶存在相互作用的水。以氨基酸残基和水为节点,残基-残基及残基-水相互作用为边,构建残基-水相互作用网络。计算网络中节点的度、聚类系数、接近中心性和节点中心性,发现水的这些参数均与木聚糖酶耐热性成正相关关系。耐热木聚糖酶中度为2的hub水数量要比常温酶多,可见水在耐热木聚糖酶中参与了更多的相互作用。以度为2的水为聚类中心,以氨基酸残基节点的度18为阈值进行聚类。子网表明hub水多与hub残基聚为一类,即网络存在富人俱乐部现象。这表明,水不仅参与了耐热木聚糖酶的残基-水相互作用,还加强了残基-残基相互作用,更有利于酶形成稳定的结构来抵御高温。     

木聚糖酶热稳定性化学修饰研究

采用不同化学修饰剂对毕赤酵母工程菌所产的木聚糖酶进行化学修饰,结果发现用聚乙二醇(diamino-PEG)对酶进行的化学修饰,提高了酶的热稳定性。通过对化学修饰木聚糖酶条件的优化,最终确定了修饰反应体系中,木聚糖酶、diamino-PEG和偶联剂(EDAC/NHS试剂)的摩尔比为1∶1 000∶100。该修饰反应得到的修饰酶,在55℃保温10 min后,残余酶活力为61.6%,比原酶提高了29.1%,通过对酶学性质的分析,发现修饰酶只有pH稳定性、热稳定性发生了改变。     

米曲霉形态对L-苹果酸生产的影响

L-苹果酸是一种重要的C_4化合物,广泛应用于食品、化工和医药行业。本文中以米曲霉为出发菌株,研究氮源种类、CaCO_3质量浓度、搅拌转速和通气量等关键营养条件和环境条件对Aspergillus oryzae形态和产L-苹果酸的影响。最优发酵条件为:胰蛋白胨为氮源、CaCO_3质量浓度为80 g/L、搅拌转速为600 r/min、通气量为2 vvm。进一步分析菌体形态与L-苹果酸产量的关系,得出当单位体积发酵液菌球总体积(V值)为76.4 mm3/mL时,L-苹果酸产量最高达109.9 g/L。     

黑曲霉产木聚糖酶的特性

研究了木聚糖酶产生菌黑曲霉(A.niger)238的产酶特性和麸曲的浸提条件,并对其浸提酶液进行浓缩.结果表明,菌株黑曲霉(A.niger)238产木聚糖酶受诱导物的影响,发酵时间在68～72h期间达到产酶高峰,酶活力为286U/mL.最佳氮源为(NH4)2SO4,装料量为每瓶10g,接种量为每瓶0.3mL.其发酵麸曲用固液比为1∶5的2g/dLCaCl2溶液,30℃浸提1.5h;浸提液采用25℃,40kPa,冷却水温度18℃条件超滤浓缩可获得90%以上回收率.     

黑曲霉产木聚糖酶的研究

筛选了 1株高产木聚糖酶的黑曲霉 (Aspergillusniger)An 2 3 8菌株 ,研究了其在固态培养基中的产酶条件。该菌株发酵曲中除含有木聚糖酶 5 117U /g(干曲 )外 ,还有纤维素酶 42 5U/g(干曲 ) ,果胶酶 12 3 6U/g(干曲 ) ,蛋白酶 2 2 5 3 1U/g(干曲 )。     

DJS水系对米曲霉酶活力提高的研究

研究了DJS水系在酿造酱油制曲中产酶及其活力的影响。试验中与自来水介质进行比较,结果表明:DJS水系能改变米曲霉的孢子数,对其酶活力的提高有显著的影响;在DJS-A介质中的孢子产量虽少于DJS-B介质,而其中的酶活力却较高。