牛凝乳酶原基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特性的研究

凝乳酶是制造干酪的关键酶。为获得高活性的牛凝乳酶（chymosin,B-chy）,用电脉冲法将线性化的pGAPZαA-B-pchy重组表达载体转化到毕赤酵母GS115中。该菌株在以葡萄糖为碳源的YPD培养基中可分泌表达牛凝乳酶原。SDS-PAGE分析表明所表达的牛凝乳酶,分子量约为37ku,符合预期大小。发酵培养96h后,酶活力达到96SU/mL。酶学特性分析表明,其最适凝乳温度为60℃,在pH2⁶、小于50℃的温度范围内稳定。Ca2+浓度为40mmol/L时,钙促酶反应活性达到最高,此后随着Ca2+浓度的增加酶活力逐渐降低。金属离子Al3+、Mn2+、Fe2+、Mg2+和K+对酶活力具有显著的促进作用,而Co2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+对酶活力具有显著的抑制作用。本研究优化了凝乳酶的表达条件,为凝乳酶工业化生产提供了理论基础。      

原核表达重组牛凝乳酶的纯化

原核表达获得的重组牛凝乳酶与商品重组牛凝乳酶有相似的酶学特性,具商业潜力,故进一步研究其纯化方法。使用离心与饱和硫酸铵沉淀,成功纯化出有活性的重组牛凝乳酶。蛋白最终回收率为1.82%,总活力比纯化前提高了73.3%,比活力提高了95.3倍。同时,讨论了如何提高包涵体复性率与产物回收率,为今后该酶的工业化生产提供技术参考。     

重组凝乳酶的酶学特性研究

对重组毕氏酵母菌分泌表达的凝乳酶进行酶学特性研究.结果表明,该酶最适凝乳温度为45℃;最适pH值为5.0;在45℃以下可以保持相对稳定的活力,55℃(6 min)丧失全部活性;酶在4.0～7.0之间凝乳活性稳定;该酶在押肽酶、亮抑酶肽、苯甲基磺酰氟、1,10-菲咯啉等蛋白酶抑制剂的作用下均保持了大部分的活性,浓度为1μmol/L胃蛋白酶抑制剂Pepstain A可以明显抑制重组凝乳酶的活性.研究结果证明了重组凝乳酶与商品凝乳酶酶学特性相近,可以应用于干酪生产.     

牛凝乳酶全长cDNA的克隆及其原核表达载体的构建

从小牛皱胃中提取凝乳酶(Chymosin)总RNA,经过RT-PCR获得凝乳酶cDNA,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶全长基因序列。序列测定表明,凝乳酶全长核苷酸长度为1 143 bp,编码381个氨基酸。与GenBank上已发表序列NM_180994进行比较,核苷酸同源性为99.56%。将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b/Chymosin,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为凝乳酶的进一步表达奠定了基础。     

重组牛凝乳酶基因在Bacillus megaterium WH320中的表达及其酶学性质研究

对牛凝乳酶基因进行密码子优化,并首次在高效表达宿主巨大芽孢杆菌中表达。通过克隆牛凝乳酶基因,将片段与穿梭质粒pHIS1525连接,连接产物转化大肠杆菌XL-10,筛选出阳性克隆子,所获重组质粒经酶切、测序鉴定,证实含目的片段。通过原生质体转化的方法转化到表达宿主巨大芽孢杆菌WH320。用木糖诱导表达,离心取上清经镍柱亲和层析(Ni-NTA)和聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离纯化并鉴定,测定重组牛凝乳酶的酶学性质,表明在巨大芽孢杆菌中得到有效表达。为我国利用生物工程技术的方法自主生产凝乳酶提供了基础。。     

牛凝乳酶基因的克隆与表达

为了获得大量高纯度高活性的凝乳酶制剂,采用基因工程方法,从犊牛皱胃黏膜细胞中克隆得到凝乳酶基因,然后将此基因插入原核表达载体pTWIN1中,使之与几丁质结合域(CBD)-内含肽(intein)融合,从而获得原核表达质粒:pTWIN1/EchybF2.经转化大肠杆菌BL21(DE3)后,在IPTG诱导下进行凝乳酶的表达.SDS-PAGE电泳分析和酶活性实验结果显示,CBD-intein-EchybF2融合蛋白在BL21(DE3)中获得高效表达,在低温诱导时主要以可溶性蛋白的形式存在,并具有凝乳活性.     

江米酒凝乳酶酶学特性的研究

江米酒中的凝乳酶是引起我国传统乳制品米酒奶凝乳的原因.本实验对从江米酒中纯化得到的凝乳酶的酶学特性进行了研究.纯化凝乳酶的最适反应温度为45℃,酶活力在45～55℃之间比较稳定.纯化凝乳酶的最适反应pH为5.5,酶活力在pH值3.0～7.0之间比较稳定.Na 、K 、Ca2 、Mg2 、Zn2 、Mn2 、Fe2 均对凝乳酶的凝乳活力有促进作用,其中Ca2 对凝乳酶的凝乳活力有着显著地促进作用,Cu2 对凝乳活力有抑制作用.凝乳酶特异性的水解酪蛋白,而对乳白蛋白和乳球蛋白不产生水解作用.凝乳酶的酶切主要位点在α-酪蛋白第95位M的N-端,同时还存在其他酶切位点.     

牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

以实验室保存的携带凝乳酶原前体基因的重组载体pMD 19-T/bPPC为模板克隆凝乳酶原基因,经双酶切后与载体pET-30a连接得到重组载体pET-30a/bPC,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。重组蛋白经变性/复性、DEAE-Sepharose Fast Flow纯化和自催化后检测凝乳活性。结果表明,重组凝乳酶原基因在大肠杆菌中高效表达,表达量占菌体总蛋白的68%,采用Arima K方法检测,其凝乳活力达到80 SU/mL。因此,通过大肠杆菌表达系统大量制备具有生物活性的重组牛凝乳酶原的策略是可行的,研究结果为弥补国内天然牛凝乳酶的短缺提供一种途径。     

酒曲发酵产凝乳酶及其酶学特性研究北大核心CSCD

通过研究不同因素对酒曲发酵产凝乳酶的影响,确定适宜的产酶条件:酒曲添加量3%(质量分数),发酵时间4 d,培养基初始p H值为6.0,摇床转速120 r/min。利用乙醇分级沉淀对酒曲发酵液中的凝乳酶进行提取,得到体积分数为70%乙醇沉淀蛋白具有凝乳活力;进一步进行Sephadex G-75凝胶过滤得到纯化凝乳酶,并经SDS-PAGE电泳分析,确定酶的分子量为35.6 ku。对此纯化酶的酶学特性的研究表明,该酶的最适温度为40℃,p H值为5.4时酶活性最高,Ca2+,Zn2+,Mg2+和K+对酶活性具有促进作用,其中以Ca2+和Zn2+促进作用较强;Cu2+,Na+和Fe2+对酶活性有抑制作用,其中Cu2+的作用较为显著。该凝乳酶在干酪加工中具有潜在的应用前景。     

牛玻璃酸酶酶学特性的研究

以牛睾丸为原料,对纯化后玻璃酸酶的酶学性质进行研究。结果表明,牛玻璃酸酶水解透明质酸钠的最适pH和温度分别为4.5、37℃,在4⁴5℃酶活稳定性较好。NaCl和BSA浓度分别为0.2、0.45mol/L时具有较高的酶活力。金属离子抑制该酶活力的顺序为,Fe3+>Mn2+>Zn2+>Al3+>Ca2+>K+>Mg2+。硫酸软骨素A浓度为1.2mg/mL时,酶活损失31.08%。硫酸软骨素B浓度为0.012mg/mL时,酶活增加1.36%。硫酸软骨素C浓度为1.2mg/mL时,酶活损失45.07%。肝素在0.012mg/mL时对酶存在抑制作用。人类血清蛋白在0.012mg/mL时可增加1.05%的酶活。半胱氨酸使酶失活。      

米黑毛霉凝乳酶酶学性质研究

研究了米黑毛霉凝乳酶的最适温度、最适pH、热稳定性,探讨了金属离子对酶活力的影响,加酶量对酶反应的影响,测定了酶的蛋白水解活力和酶的K^m与V^m值。结果显示：酶的最适温度为70℃;最适pH6;酶液在65℃保温10min,酶活损失达96％;Na^＋和K^＋对酶稍有抑制作用,Fe^2＋对酶有促进作用,Cu^2＋对酶有强烈的抑制作用;减少酶的添加量,在规定时间内凝乳会导致凝乳酶酶活测定结果偏大;凝乳酶蛋白水解活力为1048U／g;Km为190．84g／L,Vmax=7．8678g／s。     

重组牛凝乳酶原与重组单峰驼凝乳酶原活化速率的初步比较

原核表达的重组牛凝乳酶原与重组单峰驼凝乳酶原,包涵体经溶解和复性后,酸化/中和处理获得成熟凝乳酶。酸化/中和处理两种酶原时发现二者的活化速率有明显差别。相同条件下,牛凝乳酶原在2h以内即可完全活化,而单峰驼凝乳酶原需3d以上。将牛凝乳酶propeptide序列部分或全部取代单峰驼凝乳酶原相应序列,并构建到相同原核表达载体进行表达与复性,获得的融合蛋白MUT-1和MUT-2经酸化/中和处理,MUT-1在p H 2.0~8.5范围均不能活化,MUT-2的活化情况与单峰驼凝乳酶原相同。这也暗示酶原的激活不仅涉及propeptide与酶活性部位的静电作用,还可能与凝乳酶的结构或酶活相关。