重叠延伸PCR技术构建β-环糊精葡糖基转移酶基因的定点突变原核表达载体

采用重叠延伸PCR技术对环糊精葡萄糖基转移酶基因序列中保守区域的二个氨基酸位点Y127,R254进行体外基因定点突变。将突变基因分别亚克隆进pUC-18,经PCR鉴定及序列分析,所转化的Escherichia coli BL21（DE3）中含有插入的突变基因重组质粒,结果表明成功构建了Y127F、R254F二个突变基因的重组表达载体。      

β-环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆、表达及酶学性质

获取来自坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)的编码β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-cyclodextrin glycosyltransferase,β-CGTase)的基因cgt,并将带有His-Tag去除信号肽的cgt基因克隆到表达载体p ET28a(+)后,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过热变性和Ni-NTA获得重组β-CGTase纯化酶,再通过SDSPAGE检测,蛋白分子量在74 k Da左右,并初步研究了重组β-CGTase的酶学性质。结果表明:重组β-CGTase的酶促反应的最适p H为7.0,并且在p H为5.5~10.0范围稳定,最适反应温度为为65℃,重组酶在55℃保温5 h时仍保持90%以上的活性。研究一些金属离子和化学试剂对重组酶的影响发现β-CGTase是一种金属酶,Ca~(2+)对酶的催化起关键作用,尤其是在低浓度下对酶的活性有促进作用。对重组酶的酶促反应动力学研究得出Km为3.75 mg/m L,Vmax为0.33 mg/(min·m L)。该研究成功实现了β-CGTase基因的异源表达,为进一步实现β-CGTase的工业化生产和应用奠定了基础。     

环糊精糖基转移酶定点突变及其产物特异性分析

环糊精葡萄糖基转移酶（cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase）是一种多功能酶,能够催化淀粉生成环糊精（cyclodextrin,CD）,本研究考察了Bacillus cereus的CGTase活性区域43位氨基酸与CGTase酶活力及其催化玉米淀粉形成γ-CD能力的联系。实验中共构建17 株突变株,并在大肠杆菌BL21中实现异源表达。结果表明：相比于原始酶,H43E、H43F、H43W、H43Y突变酶的活力均有所提高;产物特异性方面,除H43W突变酶外,其余突变酶的催化产物中γ-CD比例均有所升高,将43位组氨酸突变成脯氨酸、异亮氨酸和苏氨酸后得到的突变酶作用于玉米淀粉,酶的催化产物中β-CD含量均下降,γ-CD含量由20%分别升高到30.2%、28.4%、29.2%,实际产量由4.76 g/L升高到7.64、6.05、6.29 g/L,由此可见Bacillus cereus的CGTase活性区域中43位氨基酸对于CGTase的活力和产物特异性具有重要影响。     

定点突变改善β-甘露聚糖酶AuMan5A的酶学性质

基于糖苷水解酶5家族(GHF5)β-甘露聚糖酶一级、三维结构的比对和分析,对宇佐美曲霉GHF5β-甘露聚糖酶AuMan5A的关键位点氨基酸实施定点突变以获得酶学性质优良的突变酶AuMan5A~(G320D)。采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Gly~(320)的密码子GGT突变为Asp~(320)的GAC,构建出突变酶基因Auman5A~(G320D)。分别将Auman5A和Auman5A~(G320D)在毕赤酵母GS115中进行了表达,分析了表达产物AuMan5A和AuMan5A~(G320D)的酶学性质。结果表明:AuMan5A~(G320D)的最适温度Topt由突变前的65℃提升至70℃,在70℃的半衰期t_(1/2)~(70)由原酶的10 min延长至25 min;AuMan5A~(G320D)的比活性由突变前的351.2 U/mg提高到1 729.1 U/mg,其催化效率(k_(cat)/K_m)是原酶的9.3倍。将Gly~(320)突变为Asp~(320)不仅改善了AuMan5A的温度特性,而且显著提高了该酶的比活性和催化效率。     

γ-环糊精葡萄糖基转移酶的酶学性质及其产物特异性

通过克隆Bacillus clarkii 7364来源编码γ-环糊精葡萄糖基转移酶(γ-cyclodextrins glucanotransferase,γ-CGTase)的基因,构建并表达基因重组菌株E.coli BL21/pET28a(+)-γ-CGTase,对γ-CGTase酶学性质和产物特异性进行了研究。结果表明,所克隆表达的γ-CGTase分子质量为78 kDa,水解活力与环化活力在最适温度、最适pH、金属离子影响等方面均存在一定差异。以可溶性淀粉为底物,经HPLC测定催化产物中几乎无α-环糊精(α-cyclodextrin,α-CD),γ-CD/β-CD可达7.70,γ-CD转化率为15.83%,添加体积分数为10%的乙醇浓度γ-CD产量可提高89.91%,γ-CD/β-CD提高73.77%,转化率为33.44%。催化豌豆淀粉γ-CD/β-CD达12.92,转化率为19.1%,分别比可溶性淀粉提高了63.13%和22.90%。该研究为进一步提高γ-CGTase酶法制备γ-CD产量和专一性应用提供了重要的理论依据。     

环糊精葡萄糖基转移酶合成AA-2G反应条件初探

为了探究重组菌株pET-28a(+)-cgt-T1/BL21(DE3)产生的环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase）催化合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G）的效果,用LB发酵培养基表达重组蛋白CGTase-T1,经亲和纯化柱纯化并浓缩后,测定其β-环化活性和歧化活性。以维生素C(Vitamin C,VC)和β-环糊精为底物,酶法合成AA-2G,并通过单因素优化实验,进一步探究了不同糖基供体、底物浓度、pH、温度、底物比例、蛋白浓度以及反应时间对AA-2G产量的影响,对酶合成AA-2G的动力学进行了分析。结果表明：此酶具有合成AA-2G的能力,未优化前AA-2G的产量为0.67 g/L。优化后,考虑到低成本和经济效益,选择可溶性淀粉和麦芽糊精为糖基供体,当糖基供体为可溶性淀粉时,底物浓度为70 g/L,反应pH4.5,反应温度37℃,底物比例3/3(VC/糖基供体),蛋白浓度5.0 mg/mL,反应时间为42 h时,该重组CGTase催化合成AA-2G...     

β-环状糊精葡萄糖基转移酶菌株的双重诱变育种

建立以酚酞作指示剂,在琼脂固态培养基上筛选环糊精糖基转移酶高产突变株的平板快速筛选法,从土壤分离物中筛选到1株葡萄糖摹转移酶(CGTase)产生菌gxmf1,于37℃、250r/min摇床发酵3d.产酶1524U/mL.该菌株经紫外线和LiCl诱变处理后,筛选得到突变株B15,产环糊精糖基转移酶达5416U/mL,较出发菌株提高255%.连续5代传代试验表明突变株B15产酶基本稳定.     

生物合成葡萄糖基-L-抗坏血酸产酶条件及转化条件优化

采用单因素实验确立微生物发酵法产环糊精糖基转移酶培养基基本条件和工艺条件,利用此酶催化L-抗坏血酸和糖基供体β-环糊精合成葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G),并通过正交实验考察不同加酶量、反应温度、pH等因素,确立环糊精糖基转移酶合成产物最佳条件为:在浓度0.04 mol/L L-抗坏血酸,酶量20 ml,pH值7.0,温度50℃下反应15 h。     

环糊精葡萄糖基转移酶生产α-熊果苷的反应条件优化及分子改造

选择4种环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)分别为来源于Paenibacillus macerans的α-CGTase,Bacillus circulans 251的β-CGTase,Bacillus stearothermophilus NO_2和Anaerobranca gottschalkii的α/β-CGTase,研究不同种类的CGTase生产α-熊果苷的情况。以麦芽糊精为供体,对苯二酚(Hydroquinone HQ)为受体,通过CGTase和淀粉葡萄糖苷酶的两步酶法反应催化合成α-熊果苷。分别优化不同类型的酶合成α-熊果苷的条件,发现Anaerobranca gottschalkii来源的CGTase在如下最优条件下获得的HQ摩尔转化率最高,为25%:以葡萄糖当量(DE)值为9%~13%的50 g/L麦芽糊精作为供体,8 g/L HQ为受体,缓冲液pH 6.0,在40℃下反应24 h,沸水浴灭活后,加入糖化酶处理,高效液相色谱检测产物。为了进一步提高CGTase对底物的转化率,利用定点突变技术对A.gottschalkii CGTase进行分子改造,得到1个突变体Y299A,在最优的反应条件下突变体的HQ转化率可达40%。     

短小芽孢杆菌热稳定环糊精葡萄糖基转移酶粗酶酶学特性研究

从土壤分离物中筛选到一株环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucanotransferase,CGTase)产生菌CGT01.16SrDNA序列分析表明该菌与短小芽孢杆菌(Bacillus pumnilus)的同源性为99%.同时根据其生理生化特征,该菌株被鉴定为短小芽孢杆菌(B.pumilus).命名为B.pumilus.CGT01菌株.产生CGTase的最适初始pH为6.5,最适培养温度为37℃.菌株所产CGlke的最适pH值和最适反应温度分别为pH 6.5和60℃,并有较高的热稳定性.60℃条件下保温,酶活基本稳定,半衰期为35 min.酶液中添加1 mmol/L Ca2+能明显提高CGTase的稳定性,60 ℃保温1 h后,剩余酶活仍达80%以上.SDS-PAGE检测表明酶的分子量约为78 ku左右.经高效液相色谱分析表明,CGTase作用于可溶性淀粉后的主要产物为葡萄糖、麦芽糖和β-环糊精,没有检出α和γ型环糊精产物,因此所产环糊精为单一类型,不同于同种属的其他菌株所产CGTase.     

Bacillus sp.Y112环糊精葡萄糖基转移酶位点R81定点突变提高产物特异性

通过对来源于海洋芽孢杆菌Y112的环糊精葡糖基转移酶进行同源建模及氨基酸序列比对,发现N末端81位精氨酸可能影响环糊精产物特异性.本研究通过定点突变将第81位点处的精氨酸突变为苏氨酸,降低了α-环糊精的生成量,将β-环糊精的比例从64％上升至71％,提高了产物的专一性.分析原因可能与取代氨基酸残基的大小及氢键作用力的变...     

环糊精葡萄糖基转移酶分离纯化及酶学性质研究

通过筛选和诱变获得一株高产环糊精葡萄糖基转移酶芽孢杆菌菌株,研究该菌所产环糊精葡萄糖基转移酶的分离纯化及酶学性质,结果显示：发酵液经离心处理后,采用硫酸铵溶液分步盐析、DEAE-cellulose 52 离子交换层析、Sephadex G-200 凝胶过滤层析方法得到电泳级环糊精葡萄糖基转移酶,SDS-PAGE 电泳显示该酶分子量为33kD,纯化倍数为10,得率为14.4%。该酶反应的最适温度为50℃,在40～60℃基本稳定,最适pH 值为8.0,在pH6.0～10.0 范围内基本稳定。Fe2+、Cu2+、Mg2+ 对该酶活力有明显的抑制作用。     

CGTase合成γ-环糊精的酶促反应条件优化

采用筛选到的一株嗜碱芽孢杆菌,研究它所产生的环糊精糖基转移酶生产环糊精的工艺条件,重点探讨酶促反应条件对环糊精糖基转移酶生产γ-环糊精的影响。结果表明:环糊精糖基转移酶生产γ-环糊精的最佳工艺为反应体系的pH 8.0,温度60℃,环糊精糖基转移酶的酶量500U/g.淀粉,甘草酸浓度2%,淀粉的DE值6～11,在该条件下制备的产品得率最高;蕉藕淀粉和木薯淀粉在生产γ-环糊精时是环糊精糖基转移酶比较合适的底物;普鲁蓝酶对γ-环糊精的产量增加作用有限。     

产β-环糊精葡萄糖基转移酶高温菌株HY15发酵条件优化

以一株产β-环糊精葡萄糖基转移酶（β-CGTase）的嗜热菌株HY15为研究对象,采用单因素试验研究碳源、氮源、初始pH值、培养温度、MgSO4·7H2O等对酶活力影响。并设计正交试验优化其发酵条件。结果表明最优的发酵条件为：碳源为玉米淀粉+糖蜜,氮源为玉米浆,初始pH7.0,培养温度60℃、摇床转速220r/min,MgSO4浓度10mmol/L,在此条件下,β-CGTase酶活力可达1794.3U/mL。     

葡萄糖基β-环糊精对面包品质影响的研究

通过感官评定、质构仪分析和电镜观察,比较添加了葡萄糖基-β-环糊精的样品面包和未添加β-环糊精的面包在面包品质方面的差异。研究结果表明,当添加葡萄糖基-β-环糊精占面粉2%时,面包的感官特性和储藏性能得到显著改善。      

葡萄糖基β-环糊精对面包品质影响的研究

通过感官评定、质构仪分析和电镜观察,比较添加了葡萄糖基-β-环糊精的样品面包和未添加β-环糊精的面包在面包品质方面的差异。研究结果表明,当添加葡萄糖基-β-环糊精占面粉2%时,面包的感官特性和储藏性能得到显著改善。     

麦芽三糖基-β-环糊精的结构

用高效液相色谱法对制备得到的麦芽三糖基-β-环糊精进行纯度分析,应用电喷雾质谱测定了麦芽三糖基-β-环糊精的分子量,用傅里叶变换红外光谱、酶解分析以及1H NMR,13C NMR和HMBC谱分析技术对麦芽三糖基-β-环糊精进行结构表征。结果表明:麦芽三糖基-β-环糊精纯度达到99%以上,分子质量为1 620.5,其结构为单取代-6-O-α-D-麦芽三糖基-β-环糊精。     

常压室温等离子诱变选育β-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株及发酵工艺研究

目的以嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)为出发菌株,利用常压室温等离子体快速诱变技术筛选β-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株,并对其发酵工艺进行优化。方法采用平板菌落透明圈大小结合摇瓶发酵酶活测定进行菌株筛选和发酵工艺优化。结果筛选出一株遗传稳定性好的β-环糊精葡萄糖基转移酶高产突变株HX188,在5 m~3发酵罐装料系数为55%的条件下,经连续6代发酵生产试验,发酵周期平均为40 h,产酶水平可稳定在6302 U/m L左右,较出发菌株2803 U/m L提高了124.8%;其最佳发酵工艺条件为:玉米淀粉2%,豆粕粉5%,pH 8.7,温度37℃,溶氧水平为20%,适时流加玉米淀粉、氮源和乳糖可提高菌体浓度及β-环糊精葡萄糖基转移酶酶活力。结论筛选出的突变株HX188遗传稳定性好,产酶能力强,能够满足工业化生产的需要。     

β-环糊精及衍生物在食品工业中的应用研究

β-环糊精是环糊精的一种,是引人注目的一种新型包合材料。 β-环糊精及衍生物因其独特的理化性质及包合作用在食品工业中的应用研究日益广泛,本文主要介绍了 β-环糊精的特性以及 β-环糊精衍生物羧甲基-β-环糊精、乙基化 β-环糊精、羟丙基- β-环糊精、甲基- β-环糊精的制备方法及特性。对制备 β-环糊精包合物的液相法,半固相法,固相法以及其在食品工业中的应用前景也做了一定的介绍,以期对 β-环糊精及衍生物的进一步开发研究提供一定的帮助。     

嗜碱性类芽孢杆菌产β-环糊精葡萄糖基转移酶发酵条件的优化

以一株Ε-环状糊精葡萄糖基转移酶高产菌株YR为研究对象,对其发酵条件及酶学特性进行初步研究。对该菌株发酵培养基的碳源、氮源和p H进行单因子分析,并对该3个因素进行正交实验确定该菌的最佳发酵培养基配方为:0.3%马铃薯淀粉,0.5%酵母膏,0.13%K2HPO4?3H2O,0.5%Na2CO3,0.02%Mg SO4?7H2O,p H为9.0。在该条件下,菌株YR产Ε-CGTase的酶活由优化前1620.28U/m L提高到4456.34U/m L,比出发菌酶活提高了2.75倍。