薯蓣皂苷糖苷酶基因的克隆及同源性分析

[目的]从分子生物学水平上研究Absidia sp.G3d产薯蓣皂苷糖苷酶,对该酶基因CDS区的序列进行调取和分析.[方法]根据薯蓣皂苷糖苷酶的N端序列设计简并引物,以总RNA为模板进行RT-PCR调取cDNA,然后采用3RACE和5RACE技术,调取CDS区基因全序列.[结果]测序得到序列长度为1 497 bp.该基因的同源性比较分析表明,薯蓣皂苷糖苷酶基因与α-鼠李糖苷酶没有同源性,与α-淀粉酶的基因序列具有很高的同源性,达到93%以上.[结论]蛋白质结构存在差异,酶反应特性不同.     

黑曲霉糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母X33中的表达

[目的]以毕赤酵母(Pichia pastoris)X33为宿主菌高效表达黑曲霉(Aspergillus niger)糖化酶,为进一步扩大糖化酶在工业上的应用奠定基础.[方法]利用RT-PCR技术,提取黑曲霉总RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,根据NCBI数据库中A.niger CBS513.88糖化酶的cDNA序列(glaA)设计引物,通过PCR扩增得到去除天然信号肽的糖化酶成熟肽编码基因glaAm,并将其克隆到pUC19载体中,序列分析表明,glaAm的开放阅读框由1 879个核苷酸组成,编码625个氨基酸.以此片段构建了pFLDα-glaAm重组表达载体,经Nsi I线性化后,电击转化毕赤酵母X-33.摇瓶培养中通过添加终浓度为0.5%的甲醇诱导糖化酶的分泌.[结果]SDS-PAGE和Starch-PAGE显示,糖化酶得到正确的分泌表达,且具有较高的生物活性,发酵上清液中酶活最高达到380.78 U/ml(发酵液).重组糖化酶的最适反应温度和最适pH分别为60～65℃和4.0,在pH 2.5～5.5范围内均保持90%以上的酶活力.该酶具有较高的热稳定性,pH 4.0条件下,该酶在50℃下稳定;60℃处理60 min,仍能保持90%以上的酶活力;65℃下的半衰期约为44 min.[结论]黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中得到了异源高效表达.     

皂苷鼠李糖苷酶RhaG和RhaD的酶反应特性研究

[目的]研究皂苷鼠李糖苷酶RhaG 和RhaD 的酶反应特性.[方法]对微生物Absidia sp.G3g 菌产的人参皂苷糖苷酶(RhaG)和Absidia sp.DOd菌产的薯蓣皂苷糖苷酶(RhaD)分别进行分离纯化,并对2种提纯酶的分子量和酶性质进行了研究.[结果]RhaG 和RhaD 的酶蛋白分子质量分别为61、56 kDa.RhaG的酶反应最适pH为5.0,pH 稳定范围为3.0-7.0;最适温度为40℃,30～60℃温度稳定性较好;米式常数Km为9.523 mmol/L.RhaD的酶反应最适pH为5.0,pH稳定范围为3.0～7.0;最适温度为40℃,30～50℃温度稳定性较好;米式常数Km为8.834 mmol/L.[结论]该研究为进一步探明2 种酶间的差别奠定了基础.     

rcanl-1l基因的克隆和表达

从小鼠脑组织中通过总mRNA的提取、RT-PCR方法,利用pEASY-T1载体克隆出了鼠源rcanl-1l基因,并构建出了重组有rcan1-1l基因的PET21a原核表达质粒,进行了表达条件的初步摸索,这为今后研究roanl-1l基因以及蛋白的结构与功能打下了前期实验基础.     

猪胎儿成纤维细胞APOE基因的差异表达研究

[目的]研究APOE基因在不同代数的猪胎儿成纤维细胞中的差异表达.[方法]收集正常传代生长的1、10、15、20、25、50代猪胎儿成纤维细胞,分别提取细胞总RNA.采用RT-PCR技术,检测不同代数猪胎儿成纤维细胞中APOE基因的表达.[结果]猪APOE基因在第1代猪胎儿成纤维细胞中表达水平最高,随着细胞代数的增加,表达童逐渐下降,到第50代表达童为最低.[结论]APOE基因在不同代数的猪胎儿成纤维细胞中有选择性表达的趋势.     

肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达

[目的]研究肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达.[方法]以肝素黄肝菌为模板,通过PCR从肝素黄杆菌基因组DNA中扩增2-O-sulfatase的基因,测序正确后插入到表达质粒PET-28a(+)上构建表达载体,重组质粒转化E.Coll BL21(DE3)进行蛋白质表达.[结果]成功地将PCR扩增得到的测序正确的2-O-sulfatase基因构建入PET-28a(+)载体上,重组质粒转入E.Coil BL21(DE3)后,表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白.[结论]克隆并成功表达了黄杆菌2-O-sulfatase基因,为分析肝素多糖分子及其降解产物结构奠定了基础.     

颠茄H6H基因的克隆及高效植物表达载体的构建

[目的]克隆颠茄(Atropa belladonna)H6H基因并构建高效植物表达载体.[方法]采用RT-PCR方法从颠茄中克隆莨菪碱-6β-羟化酶和1,4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因编码区,插入经改造后获得双元三价植物高效表达载体p2301-gus,构建植物表达载体p2301-H6H,并将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404和发根农杆菌C58C1.[结果]获得了可直接用于遗传改良的颠茄工程菌p2301-H6H-LBA4404和p2301-H6H-C58C1.[结论]为利用植物基因工程技术提高颠茄中生物碱含量奠定了基础.     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白pilA基因的克隆与表达

[目的]克隆和表达副猪嗜血杆菌菌毛蛋白pilaA基因.[方法]对已发表的HPS的pilA序列进行分析;合成引物,并以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS的pilA编码基因,获得目的基因片段;构建重组表达质粒,经IPTG诱导表达至大肠杆菌BI21(DE3)中,进行SDS-PAGE与Western blot检测.[结果]表达的重组蛋白分子质量与预期的43 kD一致.[结论]该研究为制备亚单位疫苗和诊断试剂奠定了基础.     

人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白激酶-2C端基因的克隆与鉴定

目的:获得人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白激酶-2(MASP-2)C端编码基因,并表达人MASP-2 C端片段,为制备单克隆抗体及应用于临床相关疾病的检测奠定分子学基础.方法:采用RT-PCR技术从人胎肝组织总RNA中扩增人MASP-2 C端的cDNA,克隆入pGEX-6p-2表达载体,酶切图谱分析和序列分析鉴定.结果:获得编码人MASP-2 C端片段的cDNA,并且与pGEX-6p-2载体连接,转化大肠杆菌XL1-blue,成功构建人MASP-2 C端片段cDNA的重组克隆.重组质粒酶切图谱分析和DNA测序分析,人MASP-2 C端片段cDNA的重组克隆与GenBank中人MASP-2 C端的cDNA序列一致.结论:成功克隆了人MASP-2 C端片段cDNA,并在大肠杆菌中表达人MASP-2 C端多肽片段.     

刺五加叶皂苷对实验性血管性痴呆大鼠学习、记忆及病理损伤的保护作用

目的:观察刺五加叶皂苷(ASS)对大脑中动脉闭塞(MCAO)引起的大鼠实验性血管性痴呆的影响,为ASS的进一步开发提供依据.方法:Wistar大鼠随机分为假手术组、血管性痴呆模型组及ASS 低、中、高剂量组.采用MCAO法制备大鼠血管性痴呆模型,造模10 d 后ASS低、中、高剂量组大鼠腹腔注射ASS(25、50和100 mg·kg-1),连续给药20 d.采用Morris水迷宫检测大鼠空间学习、记忆能力;取脑组织行病理学检查,并检测乙酰胆碱酯酶(AchE)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性.结果:Morris水迷宫检测,ASS 50和100 mg·kg-1组大鼠第4、5天的逃避潜伏期及游泳路径与模型组比较均显著降低(P<0.05或P<0.01),原平台象限游泳时间(tP)和路径(dP)与总游泳时间(tT)和总路径(dT)之比与模型组比较均显著增加(P<0.05).脑AchE和ChAT活性测定,与模型组比较,ASS 50和100 mg·kg-1组大鼠脑组织AchE活性明显降低(P<0.05),ASS 100 mg·kg-1组大鼠ChAT活性明显升高(P<0.05).脑组织病理学检查,模型组大鼠脑组织存在明显梗死病灶,海马CA1区神经细胞数量明显减少、排列紊乱,局部脑组织坏死液化;ASS组梗死病灶减小,海马CA1区神经细胞排列较规则,细胞脱失有所改善.结论:ASS能增强血管性痴呆大鼠的学习、记忆能力,改善脑组织病理变化,可能与其降低AchE活性、增加ChAT活性及促进乙酰胆碱合成有关.     

犬IL-2基因克隆及原核表达

[目的]研究犬IL-2基因的克隆和表达,为开发新型免疫增强荆和基因工程疫苗提供理论支持.[方法]从犬全血中分离出白细胞,经刀豆素刺激培养20 h后,提取总RNA;根据GenBank 中犬IL-2基因序列,设计1对引物,进行PCR扩增,并构建原核表达载体pET-28a,将其转化到宿主菌B121中,经IPTG 诱导表达.表达产物用SDS-PAGE进行分析.[结果]RT-PCR 扩增出一条约500 bp的条带,与预期结果相符;重组质粒pMD18-T-IL2 经双酶切后,产生一个约500 bp基因片段,说明目的基因被成功克隆;表达载体pET-28a-IL2 经双酶切和PCR鉴定后,分别产生一个约500 bp目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE 分析,分子量约为20 kDa,与预期蛋白大小基本相同.[结论]IL-2基因被成功克隆和表达.     

Glycosidase activities in Chinese hamster ovary cell lysate and cell culture supernatant

To probe the potential for extracellular degradation of glycoprotein oligosaccharides in conjunction with Chinese hamster ovary (CHO) cell culture, an initial characterization of several CHO cell glycosidases was performed using 4-methylumbelliferyl substrates. CHO cell lysates contained sialidase, beta-galactosidase, beta-hexosaminidase, and fucosidase activities with pH optimums near 5.5, 4, 6, and 6.5, respectively. These glycosidase activities were also present in cell-free supernatant samples from commercial CHO cell cultures. The sialidase activity was further characterized. In contrast to previous reports concerning mammalian sialidases, the sialidase activity in CHO cell lysate retained considerable activity at pH 7 and was very stable, with a half-life of 57 h at 37 degrees C. Both the Km and Vmax of CHO lysate sialidase for 2'-(4-methylumbelliferyl)-alpha-D-N-acetylneuraminic acid (4MU-NeuAc) varied with pH, and this activity was competitively inhibited by 2,3-dehydro-2-deoxy-N-acetylneuraminic acid and by free N-acetylneuraminic acid. The kinetic characteristics and pH-activity profiles of the CHO cell lysate and cell culture supernatant sialidase activities were essentially identical, and both released sialic acid from the glycoprotein fetuin at pH 7.5. These results suggest that the oligosaccharides of glycoproteins secreted by CHO cells can potentially be modified extracellularly by sialidase under culture conditions which promote the release and extracellular accumulation of this enzyme.     

内嵌基因表达式编程及其在函数发现中的应用

为了提高表达效率,提出了新的基因解码方案,形成了内嵌基因表达式编程算法EGEP;提出了极大表达树、嵌套表达树和拼接表达树等概念;分析了基因的表达空间和算法的复杂度.实验表明,该算法提高了函数发现的成功率;在小规模种群的函数中其能力明显优于GEP.在单基因情况下,目标为一元函数和二元函数时,EGEP平均成功辈数分别为GEP算法的25.5%和16.3%;各种规模下,在EGEP算法中二元函数的成功率平均比GEP提高43%以上.     

梅花鹿鹿茸细胞端粒酶活性及其mRNA表达的检测

[目的]研究鹿茸生长期端粒酶的表达,为揭示鹿茸生长发育的调控机制提供了新思路.[方法]在鹿茸快速生长阶段,采用改进的TRAP(端粒重复序列扩增技术)法检测鹿茸顶端增殖区的间充质层、前软骨层和软骨层细胞及下端成熟区的端粒酶活性.同时,采用RT-PCR的方法检测各组织细胞中端粒酶催化亚基(TERT)mRNA的表达水平.[结果]在顶端增生区各组织细胞中均检测到了不同程度的端粒酶活性,间质细胞、前软骨细胞和软骨细胞中的相对端粒酶活力分别为91.2、46.4和13.7,而在成熟区组织中则检测不到端粒酶活性.RT-PCR法检测的各组织细胞中TERT mRNA的表达水平与端粒酶活性检测结果一致.[结论]在鹿茸快速生长阶段,其增殖区表达端粒酶,并且端粒酶活性随组织层细胞的分化程度的增高而逐渐降低,说明端粒酶可能在鹿茸的生长过程中起重要的调控作用.     

Effect of Lanthanum on Expression of Recombinant Allophycocyanin Gene in Pichia Pastoris

The methylotrophic yeast ,Pichia pastorishasbeen developed to be an outstanding host for the pro-duction of foreign proteins since its alcohol oxidasepromoter was isolated and cloned ,and its transforma-tion was first reported in 1985[1 ,2].This organismh…     

Effect of Lanthanum and Cerium on Expression of RSCU-PA-32k Gene in Saccharomyces Cerevisiae

Ｃｕｒｒｅｎｔｌｙｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄｌｅｔｈａｌｉｔｙｏｆｔｈｒｏｍｂｕｓｉｌｌｎｅｓｓａｒｅｖｅｒｙｈｉｇｈ ,ａｎｄｉｔｓｅｒｉｏｕｓｌｙｔｈｒｅａｔｅｎｓｐｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈ .Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｓｔｏｔｒｅａｔｔｈｅｄｉｓ ｅａｓｅ .Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ (ｓｃｕ ＰＡ 3 2ｋ )ｏｆｌｏｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ(3 2ｋＤ)ｗａｓｄｉ…     

植物4CL基因家族结构功能与表达特性研究进展

4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)是植物苯丙烷衍生物,如类黄酮和木质素等,生物合成途径的一种关键酶,在大多数雏管植物中4CL基因以基因家族的形式出现.4CL基因家族成员在植物组织中存在差异表达,并参与不同的苯丙烷类衍生物的生物合成.从4CL酶的基因结构、基因家族组成与表达特性等方面详细论述了当前最新研究进展,这将有助于更好地理解植物4CL基因参与苯丙烷类衍生物途径的合成与代谢机制.