产L-亮氨酸营养缺陷型突变株黄色短杆菌SFL8-3的选育

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是生物体内不可缺少的营养成分，L-亮氨酸是人体8种必需氨基酸之一，也是三种支链氨基酸之一，在医药、食品、饲料、化妆品等行业具有重要的用途。以一株黄色短杆菌为出发菌株，经紫外线、盐酸羟胺和硫酸二乙酯等多次诱变处理，单菌落分离、摇瓶初筛和摇瓶复筛，获得了一株蛋氨酸和异亮氨酸双重缺陷型突变株SFL8-3（Met^-，Ile^-），摇瓶发酵L-亮氨酸产量达18．98g／L。     

双重营养缺陷型（Met^-，Ile^-）黄色短杆菌突变株SFL8-3的选育

以一株黄色短杆菌SFL-8为出发茵株，经紫外线、盐酸羟胺和硫酸二乙酯等多次诱变处理，单菌落分离、摇瓶初筛和摇瓶复筛，获得了一株蛋氨酸和异亮氨酸双重缺陷型突变株SFL8-3(Met^-，Ile^-)，摇瓶发酵L-亮氨酸产量达18．98g／L。     

L-亮氨酸生物合成关键酶基因的克隆和表达

通过PCR获得黄色短杆菌ATCC14067基因组上编码L-亮氨酸合成途径中关键酶的基因.连接大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达质粒pDXW-8构建多种重组质粒,分别转化模式菌株C.glutamicum ATCC13032考察对其发酵生产L-亮氨酸的影响.经摇瓶发酵实验显示:C.glutamicum ATCC13032发酵液中没有L-亮氨酸的积累而基因工程菌ATCC13032/pDXW-8-leuA-ilvBNC中L-亮氨酸的产量达4.75g/L.     

L-亮氨酸的生理功能和分离纯化技术

L-亮氨酸(L-leucine)为人体和动物的必需氨基酸之一,同时也是三大支链氨基酸之一,是一种极其重要的生物化工产品。文章介绍了L-亮氨酸在医药、营养、化工等方面的应用,综述了其现有的分离纯化技术,最后分析了影响L-亮氨酸分离纯化的相关因素,并对L-亮氨酸的其他分离纯化技术进行了展望。     

L-亮氨酸的性质、生产及应用

L-亮氨酸，又称白氨酸，化学名为α-氨基异己酸，1819年Proust首先从奶酪中分离得到，后来Braconnot从肌肉与羊毛的酸水解物中得到其结晶，并定名为亮氨酸。L-亮氨酸是常见十八种氨基酸中的一种，也是人体八种必需氨基酸之一，另外由于L-亮氨酸和L-异亮氨酸、L-缬氨酸的分子结构中都含有一个甲基侧链而被称为支链氨基酸(Branched chain amina acids，BCAA)。     

L-亮氨酸高产菌TGL8207的定向选育及其发酵过程研究

以谷氨酸棒杆菌TG95为出发菌株,通过原生质体紫外诱变、原生质体融合和硫酸二乙酯诱变,定向选育L-亮氨酸产生菌TGL8207.该菌株在未优化条件下摇瓶发酵72 h,产L-亮氨酸27.2 g/L,并且菌株的遗传标记和产酸能力十分稳定.研究了温度、pH和溶氧对菌株TGL8207积累L-亮氨酸的影响.采用10 L罐补料分批发酵64h,L-亮氨酸产量达44.5 g/L,糖酸转化率达22.8%.     

基因敲除降低L-缬氨酸发酵中亮氨酸和异亮氨酸含量的研究

黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)是L-缬氨酸生产的重要菌株,但缬氨酸发酵中常出现亮氨酸、异亮氨酸含量超标的问题.本研究敲除编码黄色短杆菌亮氨酸和异亮氨酸合成的关键基因,自主构建得到了工程菌株MH-1000-△ilvA、MH-1000-△leuA和MH-1000-△ilvA△leuA.对这些工程菌株进行摇瓶发酵和50 L罐发酵,结果表明,工程菌株有效地降低了L-缬氨酸发酵液中L-亮氨酸和L-异亮氨酸的含量,对于缬氨酸的高纯度生产具有一定的实际意义.     

L-亮氨酸发酵工艺条件的研究

研究了能积累L-亮氨酸的黄色短杆菌TL0412的菌体生长规律，并讨论了葡萄糖、玉米浆以及蛋氨酸等几个主要的营养物质对其积累L-亮氨酸的影响，确定了较优的发酵备件，种龄36h，接种量为10％，在此条件下72h摇瓶产酸可达19．4％。在上述基础上，研究了不同温度、溶氧、pH值对菌株TL0412积累L-亮氨酸的影响，采用10L罐实验64h可积累29．47％亮氨酸。     

L-亮氨酸摇瓶补料分批发酵实验

进行了补葡萄糖、补醋酸铵和硫酸铵和全组分补料的摇瓶补料分批发酵实验。实验结果显示,以初始葡萄糖浓度为50g/L,初始醋酸铵和硫酸铵浓度分别为10g/L,于发酵过程第24h起每隔12h分4次补加全组分发酵培养基,摇瓶发酵72h产L-亮氨酸21.32g/L。     

钝齿棒状杆菌产赖氨酸突变株的选育

用N-甲基-N′-硝基—N—亚硝基胍(NTG)对钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum)W L1.0245进行了诱变处理,获得了高丝氨酸、蛋氨酸、亮氨酸及丙氨酸营养缺陷型和S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)抗性突变株,并经摇瓶筛选出几株能产生L-赖氨酸的钝齿棒状杆菌AEC抗性株、高丝氨酸缺陷型株和高丝氨酸缺陷型兼AEC抗性突变株。TR-275菌株(Thr~-AECr)在筛选培养基中发酵累积L-赖氨酸盐酸盐25.6mg/ml(对葡萄糖的转化率25.6%)。